Summary

وضع العلامات والتصوير من لويحات اميلويد في انسجه المخ باستخدام الكركمين البوليفينول الطبيعية

Published: November 01, 2019
doi:

Summary

الكركمين هو فلوكوفيري مثاليه لوضع العلامات والتصوير من لويحات بروتين بيتا اميلويد في انسجه المخ نظرا لارتباطها التفضيلية إلى بروتين بيتا اميلويد ، فضلا عن أوجه التشابه الهيكلية مع غيرها من الاصباغ التقليدية الملزمة اميلويد. ويمكن استخدامه لتسميه وصوره لويحات بروتين بيتا اميلويد أكثر كفاءه وغير مكلفه من الأساليب التقليدية.

Abstract

ترسب بروتين بيتا اميلويد (Aβ) في المساحات الخارجة وداخل الخلايا هي واحده من الامراض المميزة لمرض الزهايمر (AD). ولذلك ، فان الكشف عن وجود Aβ في انسجه المخ AD هو أداه قيمه لتطوير العلاجات الجديدة لمنع تطور AD. وقد استخدمت العديد من الاصباغ الكلاسيكية الملزمة اميلويد ، الفلوروكروم ، وتحقيقات التصوير ، والأجسام المضادة الخاصة Aβ للكشف عن الرسوم البيانية Aβ في انسجه المخ AD. استخدام هذه المركبات للكشف عن Aβ مكلفه وتستغرق وقتا طويلا. ومع ذلك ، بسبب نشاطها الفلورسنت مكثفه ، عاليه التقارب ، والخصوصية ل Aβ ، فضلا عن أوجه التشابه الهيكلية مع الاصباغ التقليدية الملزمة اميلويد ، الكركمين (Cur) هو مرشح واعده لوضع العلامات والتصوير من لويحات Aβ في تشريح الجثة انسجه المخ. وهو البوليفينول طبيعيه من عشبه كركم لونغا. في الدراسة الحالية, وقد استخدمت الصورة الكترونيه لتصنيف لويحات Aβ التسمية من كل من نموذج الماوس الوراثية لمرض الزهايمر العائلي 5x (5Xبدعه) ومن الانسجه البشرية الاعلانيه في غضون دقيقه. تم مقارنه القدرة علي وضع العلامات من Cur إلى الاصباغ التقليدية الملزمة اميلويد ، مثل ثيوفلافين (Thio-S) ، الكونغو الأحمر (CR) ، وفلورو-اليشم C (FJC) ، فضلا عن الأجسام المضادة الخاصة Aβ (6E10 و A11). لاحظنا ان Cur هو الطريقة الأكثر تكلفه وأسرع لتسميه وصوره لويحات Aβ بالمقارنة مع هذه الاصباغ التقليدية وقابله للمقارنة إلى الأجسام المضادة المحددة Aβ. الاضافه إلى ذلك ، يربط Cur مع معظم الأنواع Aβ ، مثل قله المواليد وألياف الليفية. ولذلك ، يمكن استخدام Cur باعتبارها الأكثر فعاليه من حيث التكلفة ، وبسيطه ، وسريعة الفلوروكروم عامل الكشف عن لويحات Aβ.

Introduction

مرض الزهايمر (الإعلان) هو واحد من الاضطرابات العصبية الأكثر شيوعا المرتبطة بالسن والتقدمية واحده من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع انحاء العالم1,2. ان التعلم والذاكرة وضعف الإدراك ، إلى جانب الاضطرابات النفسانية العصبية ، هي الاعراض الشائعة التي تظهر في AD3. علي الرغم من ان مسببات AD لم يتم توضيحها بالبالكامل ، تشير الادله الوراثية والبيوكيميائية والتجريبية المتاحة إلى ان الترسب التدريجي لل Aβ هو مؤشر حيوي نهائي ل AD4. يتراكم هذا البروتين غير المطوي في المساحات داخل الخلايا وخارجها ، ويعتقد انه متورط في فقدان التشابك ، وزيادة التهاب العصبي ، والضمور العصبي في المناطق القشرية والهيبوكامباله في الدماغ المتضررة بواسطة AD5. لذلك ، الكشف الكيميائي النسيجي لل Aβ في الانسجه AD هو خطوه اولي حاسمه في تطوير غير سامه ، ومكافحه اميلويد المخدرات لمنع تقدم AD.

خلال العقود القليلة الماضية ، تم استخدام العديد من الاصباغ والأجسام المضادة من قبل العديد من مختبرات البحوث لتسميه وصوره لويحات Aβ في انسجه المخ ، ولكن بعض هذه الطرق هي مضيعه للوقت والاصباغ أو الأجسام المضادة المستخدمة مكلفه ، وتتطلب العديد من الملحقات المواد الكيميائيه. ولذلك ، فان تطوير وسيله غير مكلفه للكشف عن لويحات Aβ في الدماغ AD يكون أداه جديده ترحيب. بدات العديد من المختبرات باستخدام Cur ، واعده مكافحه اميلويد الطبيعية البوليفينول ، لوضع العلامات والتصوير aβ ، فضلا عن وكيل العلاجية لل6،7،8،9. هيدروفوبيسيتيها وطبيعتها ، وأوجه التشابه الهيكلية مع الاصباغ الكلاسيكية الملزمة اميلويد ، والنشاط الفلوري القوي ، فضلا عن تقارب قوي للربط مع Aβ يجعل من فلوكوفيري مثاليه لوضع العلامات والتصوير من لويحات Aβ في الانسجه AD10 . يتم الكشف عن الخلية مع aβ-لويحات وقله الطفرات ووجودها أيضا في المساحات داخل الخلايا7,11,12,13. الاضافه إلى ذلك ، فقد ثبت ان الحد الأدنى من المبالغ (1 − 10 نانومتر) من Cur يمكن تسميه لويحات Aβ في 5x مرض الزهايمر العائلي (5Xبدعه) انسجه المخ7. علي الرغم من ان تركيز 1 نانومتر لا يوفر كثافة مضان الأمثل للعد لويحات Aβ, 10 نانومتر أو تركيز اعلي من Cur لا. ركض والزملاء14 ذكرت ان جرعات منخفضه مثل 0.2 nM من ديفلوبوبورون-ديريفاتيزيد Cur يمكن الكشف في الجسم الخارجي aβ الودائع تقريبا فضلا عن مسبار الاشعه تحت الحمراء. ما إذا كانت هذه الجرعة كافيه لتسميه لويحات Aβ في الانسجه لا يزال غير واضح. وقد استخدمت معظم الدراسات السابقة 20 − 30 دقيقه لتلطيخ لويحات Aβ باستخدام Cur ، ولكن قد يتطلب تلطيخ الأمثل وقتا اقل بكثير.

تم تصميم هذه الدراسة لاختبار الحد الأدنى من الوقت المطلوب من قبل Cur لتسميه لويحات Aβ في انسجه الدماغ AD ومقارنه حساسية لوضع العلامات والتصوير من لويحات Aβ في انسجه المخ من الفئران 5xFAD بعد تلطيخ مع Cur مع التقليدية الأخرى Aβ-الاصباغ ملزمه ، مثل ثيوفلافين (Thio-S) ، الكونغو الأحمر (CR) ، وفلورو-اليشم C (FJC). تمت مقارنه القدرة علي وضع العلامات Aβ من هذه الاصباغ الكلاسيكية الملزمة اميلويد مع تلطيخ Cur في أقسام الدماغ الاكليليه والتي تحتوي علي البارافين والتي من الفئران 5xFAD ومن العمر المتطابقة AD الإنسان والسيطرة علي انسجه المخ. وتشير النتائج إلى ان Cur تسميات Aβ لويحات بطريقه مماثله للأجسام المضادة الخاصة Aβ (6E10) وأفضل باعتدال من Thio-S ، CR ، أو FJC. الاضافه إلى ذلك ، عندما تدار الحقن داخل الصفاق من Cur إلى الفئران 5xFAD لمده 2 − 5 أيام ، عبرت حاجز الدم في الدماغ وملزمه مع لويحات Aβ7. ومن المثير للاهتمام, وقد استخدمت تركيزات نانومولار من Cur لتسميه وصوره لويحات aβ في 5xfad انسجه المخ7,14. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تصنيف لويحات Aβ المتميزة من الناحية الشكلية ، مثل النواة ، والعصب ، والمنتشرة ، واللويحات المحترقة بواسطة Cur بكفاءة أكبر من اي من الاصباغ الأخرى التقليدية الملزمة اميلويد7. عموما ، يمكن تطبيق Cur علي التسمية وصوره لويحات Aβ في انسجه المخ بعد الوفاة من نماذج الحيوانية AD و/أو الانسجه البشرية AD بطريقه سهله وغير مكلفه ، كبديل موثوق بها للأجسام المضادة الخاصة Aβ.

Protocol

وقد تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية والاستخدام الحيوانية (ACUC) من جامعه الدولة وادي Saginaw. تم الحصول علي الانسجه البشرية من بنك الدماغ الراسخة في معهد الصحة راية الشمس في اريزونا15,16. 1. perfusion من الحيوانية اعداد ا?…

Representative Results

الكركمين تسميات اللويحات Aβ في غضون دقيقه. عندما كنا ملطخه 5xFAD الانسجه مع Cur ، وجدنا ان التسمية Cur Aβ لويحات في غضون 1 دقيقه. علي الرغم من زيادة وقت الحضانة مع Cur زيادة طفيفه كثافة مضان من لويحات Aβ ، وكان عدد لويحات Aβ لوحظ لا تختلف اختلافا كبيرا بين 1 دقيقه و 5 دقيقه تلطيخ الوقت …

Discussion

وكانت الفرضية التي لدينا ان Cur يمكن ان تستخدم كاسرع وأسهل ، والطريقة الأقل تكلفه لتسميه وصوره لويحات Aβ في انسجه الدماغ AD بعد الوفاة بالمقارنة مع غيرها من الاصباغ الكلاسيكية الملزمة اميلويد ، فضلا عن الأجسام المضادة الخاصة Aβ. وكانت أهداف هذه الدراسة لتحديد الحد الأدنى من الوقت اللازم لتسم…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وجاء الدعم لهذه الدراسة من معهد أعصاب الميداني في اسنسيون سانت ماري.

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) IHC world, Woodstock, MD
Aanimal model of Alzheimer's disease Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol VWR,Radnor, PA
Alexa 594 Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10 Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11 Millipore, Burlington, MA
Compound light microscope Olympus, Shinjuku, Japan Olympus BX51
Congo red Sigma, St. Louis, MO
Cryostat GMI, Ramsey, MN LeicaCM1800
Curcumin Sigma, St. Louis, MO
Disodium hydrogen phosphate Sigma, St. Louis, MO
Dystyrene plasticizer xylene BDH, Dawsonville, GA
Filter papers Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342 Sigma, St. Louis, MO
Inverted fluorescent microscope Leica, Buffalo Grove, IL Leica DMI 6000B
Inverted fluorescent microscope Olympus, Shinjuku, Japan Olympus 1×70
Normal goat serum Sigma, St. Louis, MO
Paraffin Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lysine coated charged glass slide Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Potassium chloride Sigma, St. Louis, MO
Potassium dihydrogen phosphate Sigma, St. Louis, MO
Sodium azide Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide EMD Millipore, Burlington, MA
Sodium pentobarbital Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Thioflavin-S Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100 Sigma, St. Louis, MO
Xylene VWR,Radnor, PA

References

  1. Cummings, J. L. Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
  2. Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer’s disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
  3. Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
  4. Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
  5. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
  6. Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer’s disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
  7. Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer’s disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
  8. Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
  9. Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer’s Disease. , (2017).
  10. den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer’s disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
  11. Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer’s disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
  12. Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer’s disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
  13. Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer’s patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
  14. Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
  15. Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
  16. Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
  17. Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer’s beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
  18. Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
  19. Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer’s brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
  20. Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
  21. Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
  22. Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
  23. Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
  24. Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
  25. Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).

Play Video

Cite This Article
Maiti, P., Plemmons, A., Bowers, Z., Weaver, C., Dunbar, G. Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin. J. Vis. Exp. (153), e60377, doi:10.3791/60377 (2019).

View Video