Summary

Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln, die von eisenbegrenzten Mykobakterien hergestellt werden

Published: October 31, 2019
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Summary

Mycobacterium tuberculosis zeigt eine erhöhte Produktion und Freisetzung von extrazellulären Vesikeln als Reaktion auf niedrige Eisenbedingungen. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung niedriger Eisenbedingungen und Methoden zur Reinigung und Charakterisierung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel, die als Reaktion auf Eisenmangel freigesetzt werden.

Abstract

Mykobakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis (Mtb), dem Erreger der menschlichen Tuberkulose, setzen natürlich extrazelluläre Vesikel (EVs) frei, die immunologisch aktive Moleküle enthalten. Das Wissen über die molekularen Mechanismen der Vesikelbiogenese, den Gehalt der Vesikel und ihre Funktionen an der Pathogen-Host-Schnittstelle ist sehr begrenzt. Um diese Fragen zu lösen, sind strenge Verfahren für die Isolierung, Reinigung und Validierung von Elektrofahrzeugen erforderlich. Zuvor wurde festgestellt, dass die Vesikelproduktion verbessert wurde, wenn M. tuberculosis einer Eisenbeschränkung ausgesetzt war, ein Zustand, dem Mtb in der Wirtsumgebung begegnete. Hier wird ein vollständiges und detailliertes Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Elektrofahrzeugen von eisenmangeligen Mykobakterien vorgestellt. Quantitative und qualitative Methoden werden angewendet, um gereinigte Elektrofahrzeuge zu validieren.

Introduction

Mykobakterielle extrazelluläre Vesikel (MEVs) sind membrangebundene Nanopartikel mit einer Größe von 60 bis 300 nm, die natürlicherweise von schnell- und langsam wachsenden Mykobakterien freigesetzt werden1. MEVs, die von pathogenen Mykobakterien freigesetzt werden, bilden einen Mechanismus, um mit dem Wirt über immunologisch aktive Proteine, Lipide und Glykolipide zu interagieren, die konzentriert und geschützt abgesondert werden2,3,4. Um MEVs zu charakterisieren und ihre Biogenese und Funktionen zu verstehen, sind strenge und effiziente Methoden der Vesikelreinigung und -validierung von entscheidender Bedeutung. Bisher wurden MEVs aus den Kulturfiltraten von Mykobakterien isoliert, die in einem eisenreichenMedium1,5,6,7,8angebaut wurden.

Frühere Arbeiten zeigten jedoch, dass die Eisenbegrenzung die Freisetzung von Vesikel in Mtb stark stimuliert, möglicherweise um Eisen über Mycobactin zu fangen, ein Siderophor, das in MEVs9abgesondert wird. Obwohl Verfahren für die Isolierung von MEVs von Mtb, die in eisenhohem Medium kultiviert wurden, beschrieben wurden, wurde keine effiziente Methode zur Gewinnung von MEVs aus eisenarmen Kulturen beschrieben. Daher ist das Ziel dieser Methode, MEVs aus niedrigen Eisenkulturen zu isolieren, zu reinigen und zu quantifizieren, so dass sie für biochemische und funktionelle Tests und für die Analyse genetischer Determinanten der Vesikelproduktion in Mykobakterien verwendet werden können.

Protocol

1. Vorbereitung des eisenabschöpfungsorientierten definierten Mediums Bereiten Sie 1 l minimalen Medium (MM) durch Auflösen von 5 g KH2PO4, 5 g L-Asparagin, 20 ml Glycerin und 2 g Dextrose in 900 ml entionisiertem Wasser in einem Kunststoffbehälter vor. Vermeiden Sie Glas, um Eisenkontamination zu verhindern. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 5 N NaOH und das Volumen auf 1 L mit Wasser ein. 50 g Metallchelatharz (MCR) hinzufügen und vorsichtig mit einem magnetischen Rührst…

Representative Results

MEVs wurden durch Differentialsedimentation in einem Dichtegradienten gereinigt (Abbildung 1, Abbildung 2). Unter den beschriebenen Bedingungen trennten sich DIE MEVs meist in Gradientenfraktion 3 (F3), was 25% Iodixanol entspricht. Diese Schlussfolgerung basiert auf dem Nachweis von Protein, Membranlipid, mikroskopischer Visualisierung intakter MEVs, Nanopartikelgrößenverteilung und positiver Reaktivität mit einem Antivesicle…

Discussion

Mehrere Methoden zur Reinigung von eukaryotischen Zell-abgeleiteten Exosomen wurden entwickelt12. Im Gegensatz dazu gibt es nur begrenzte Informationen über wirksame Methoden zur Reinigung von bakteriellen EVs7. Effiziente Isolierung von Mtb-abgeleiteten Elektrofahrzeugen muss die intrinsischen Schwierigkeiten beim Anbau dieses pathogenen Mycobacteriums berücksichtigen. Mtb hat eine lange Teilungszeit (24 h) und sollte unter Biosicherheitsstufe drei (BSL-3) Bedingungen be…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Rafael Prados-Rosales für die gemeinsame Nutzung der Anti-MEV-Antisera und Navneet Dogra für die Durchführung von Nanopartikel-Tracking-Analysen.

Materials

Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

References

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Cite This Article
Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

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