Summary

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer

Published: October 31, 2019
doi:

Summary

Mycobacterium tuberculosis montre une augmentation de la production et la libération de vésicules extracellulaires en réponse à de faibles conditions de fer. Ce travail détaille un protocole pour générer de faibles conditions de fer et des méthodes pour la purification et la caractérisation des vésicules extracellulaires mycobactériennes libérées en réponse à une carence en fer.

Abstract

Les mycobactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent causal de la tuberculose humaine, libèrent naturellement des vésicules extracellulaires (VE) contenant des molécules immunologiquement actives. Les connaissances concernant les mécanismes moléculaires de la biogenèse vésicule, le contenu des vésicules et leurs fonctions à l’interface pathogène-hôte sont très limitées. Pour répondre à ces questions, il faut des procédures rigoureuses d’isolement, de purification et de validation des véhicules électriques. Auparavant, la production de vésicules s’est avérée améliorée lorsque M. tuberculosis a été exposé à la restriction de fer, une condition rencontrée par Mtb dans l’environnement hôte. Présenté ici est un protocole complet et détaillé pour isoler et purifier les véhicules électriques à partir de mycobactéries déficientes en fer. Des méthodes quantitatives et qualitatives sont appliquées pour valider les véhicules électriques purifiés.

Introduction

Les vésicules extracellulaires mycobactériennes (MEV) sont des nanoparticules membranaires, de 60 à 300 nm de taille, naturellement libérées par les mycobactéries à croissance rapide et lente1. Les MEV libérés par les mycobactéries pathogènes constituent un mécanisme d’interaction avec l’hôte par l’intermédiaire de protéines immunologiquement actives, lipides et glycolipides sécrétés d’une manière concentrée et protégée2,3,4. Pour caractériser les Monos et comprendre leur biogenèse et leurs fonctions, des méthodes strictes et efficaces de purification et de validation des vésicules sont cruciales. Jusqu’à présent, les MEV ont été isolés des filtrates de culture des mycobactéries cultivées dans un milieu riche en fer1,5,6,7,8.

Cependant, des travaux antérieurs ont démontré que la limitation du fer stimule grandement la libération de vésicule dans Mtb, peut-être pour capturer le fer par l’intermédiaire de la mycobactine, un siderophore sécrété dans meVs9. Bien que des procédures d’isolement des MVE par rapport à la culture Mtb dans un milieu de fer élevé aient été décrites, une méthodologie efficace pour obtenir des MPV à partir de cultures de fer faible n’a pas été signalée. Par conséquent, l’objectif de cette méthode est d’isoler, purifier et quantifier les Monovirus obtenus à partir de cultures de fer faible afin qu’ils puissent être utilisés pour des essais biochimiques et fonctionnels et pour l’analyse des déterminants génétiques de la production de vésicules chez les mycobactéries.

Protocol

1. Préparation du milieu défini appauvri en fer Préparer 1 L de milieu minimal (MM) en dissolvant 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagine, 20 ml de glycérol et 2 g de dextrose dans 900 ml d’eau deionisée dans un récipient en plastique. Évitez le verre pour prévenir la contamination du fer. Ajuster le pH à 6,8 avec 5 N NaOH et le volume à 1 L avec de l’eau. Ajouter 50 g de résine de chélage métallique (MCR) et agiter doucement à l’aide d’une barre magnétique pendant 24 h…

Representative Results

Les Monospaces ont été purifiés par sédimentation différentielle dans un gradient de densité (Figure 1, Figure 2). Dans les conditions décrites, les MEV se sont séparés principalement en fraction de gradient 3 (F3), ce qui correspond à 25% d’iodixanol. Cette conclusion est basée sur la détection de protéines, de lipides membranaires, de visualisation microscopique de Monomètres intacts, de distribution de la taille …

Discussion

Plusieurs méthodes pour purifier les exosomes eucaryotes dérivés de cellules ont été développées12. En revanche, il existe peu d’informations sur les méthodes efficaces pour purifier les véhicules électriques dérivés de bactéries7. L’isolement efficace des véhicules électriques dérivés de Mtb doit tenir compte des difficultés intrinsèques à cultiver ce mycobactérie pathogène. Mtb a un temps de division long (24 h) et doit être manipulé dans des condi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à Rafael Prados-Rosales d’avoir partagé l’antisera anti-MEV et Navneet Dogra pour avoir effectué des analyses de suivi des nanoparticules.

Materials

Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

References

  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
  10. Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  11. Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
  12. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).

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Cite This Article
Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

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