Parietal Epitel Hücre Aktivasyonunda Yer Alan Yolları Analiz Etmek Için Ex Vivo Analizi olarak Glomerüler Büyüme
Summary
Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli glomeruli glomerual hücre outgrowths kültürve analiz için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem parietal epitel hücre çoğalması ve göç ile ilgili yolları incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Parietal epitel hücre (PEC) aktivasyonu glomerülosklerozun gelişimi ve ilerlemesinde rol oynayan önemli faktörlerden biridir. Parietal epitel hücre aktivasyonunda yer alan yolların inhibisyonu bu nedenle glomerüler hastalıkların ilerlemesini zayıflatmak için bir araç olabilir. Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli parietal epitel hücre büyümesini analiz etmek ve kültür ve analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İzole fare böbrekleri kesildikten sonra doku doğrlanır ve glomeruli eeving tarafından izole edilir. Kapsüllü glomeruli toplanır ve parietal epitel hücreleringlomerüler outgrowth elde etmek için 6 gün boyunca tek glomeruli kültürlenir. Bu dönemde parietal epitel hücre çoğalması ve göç hücre sayısı veya büyüyen hücrelerin yüzey alanı belirlenerek analiz edilebilir. Bu nedenle bu tetki, değişmiş gen ekspresyonunun transgenik veya nakavt farelerdeki etkilerini veya kültür koşullarının parietal epitel hücre büyüme özellikleri ve sinyalizasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir araç olarak kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak parietal epitel hücre aktivasyonu ve dolayısıyla glomerüloz sürecinde önemli yollar incelenebilir.
Introduction
Glomerüler hastalıklar böbrek hastalıklarının önemli bir grubudur ve son dönem böbrek hastalığının (ESRD) önemli bir nedenini temsil eder. Ne yazık ki, özel tedavi seçenekleri sınırlıdır ve ESRD ilerlemesi kaçınılmazdır. Glomerüler hastalıklar glomerüler yaralanma varlığı ile tanımlanır ve inflamatuar ve inflamatuar olmayan hastalıklarda gruplandırılabilir. İlk hakaret farklı olmasına rağmen, son çalışmalar da ortak bir hücresel mekanizma glomerüler epitel hücre hiperplazi yol açar ve sonuçta tüm glomerüler hastalıklarda glomerüskleroz yol göstermiştir, ne olursa olsun altta yatan neden1,2,3,4.
Özellikle glomerülülsikerotik lezyonların esas olarak aktive parietal epitel hücrelerinden oluştuğu gösterilmiştir5,6. Fizyolojik koşullar altında, parietal epitel hücreleri glomerulus Bowman kapsül hattı düz quiescent epitel hücreleridir. Ancak, genetik mutasyonlara bağlı glomerüler yaralanmalar (örn. podositspesifik veya mitokondriyal sitopatiler), inflamasyon veya hiperfiltrasyon (örn. böbrek kitlesinin azalması, hipertansiyon, obezite veya diyabetik mellitus nedeniyle) parietal epitel hücrelerinaktivasyonunu tetikleyebilir. Aktif parietal epitel hücreleri çoğalır ve hücre dışı matriks oluşumu ile sonuçlanan hücre dışı matriks mevduat5,7,8. Bu süreçlerin ilerlemesi böbrek fonksiyon kaybı ile sonuçlanır9. Bu nedenle parietal epitel hücre aktivasyonu hem inflamatuar hem de inflamatuar olmayan glomerüler hastalıklarda glomerülozun gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir faktördür1,2,3,4,10.
Parietal epitel hücre aktivasyonuna aracılık eden moleküler süreçler hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Son çalışmalar, hücresel proliferasyon ve göçle ilgili farklı yolların aktivasyonu için önemli olan bir reseptör olan aktif parietal epitel hücrelerinin de novo express CD44 olduğunu göstermektedir. Ayrıca, CD44 inhibisyonu parietal epitel hücre aktivasyonunu inhibe etmek ve inflamatuar yanı sıra non-inflamatuar glomerüler hastalıkların hayvan modellerinde hilal oluşumu ve glomeruloskleroz ilerlemesini zayıflatmak gösterilmiştir11,12.
Parietal epitel hücre aktivasyonu glomerüloz ve hilal oluşumu gelişimi için önemli bir oyuncu olduğundan, bu hücrelerin inhibisyonu glomerüler hastalıkların ilerlemesini yavaşlatabilir. Parietal epitel hücre aktivasyonunu yönlendiren moleküler yolların açıklanması, glomerüler hastalıkta hiperplastik ve glomeruloscl lezyonlarının oluşumunu zayıflatan spesifik terapötik girişimlerin gelişmesine yol açabilir.
Deneysel hayvan modellerinde, parietal epitel hücreleri üzerinde değiştirilmiş gen ekspresyonu (nakavt modelleri veya transgenik fare modelleri) veya ilaç tedavisinin doğrudan etkisi için kanıt sağlamak sıklıkla zordur. Konvansiyonel bir nakavt farede in vivo değişiklikler gözlenen parietal epitel hücrelerinde doğrudan değişiklikler ile açıklanabilir. Ancak, gen ekspresyonu fareiçindeki diğer hücre türlerinde de değiştirildiği için, diğer hücre türleri tarafından aracılık edilen dolaylı etkileri dışlayamaz. Parietal epitel hücrelerinde ağırlıklı olarak aktif organizatörler tarafından tahrik koşullu cre-lox farelerin geliştirilmesi bazı durumlarda bir çözüm sağlamıştır13. Bununla birlikte, koşullu transgenik modeller karmaşıktır ve daha koşullu çizgiler kullanılabilir hale gelmesine rağmen, geleneksel nakavt veya transgenik fare hatlarının çoğu için henüz koşullu bir alternatif yoktur.
Parietal epitel hücreleri üzerindeki doğrudan etkileri incelemek için grubumuz parietal epitel hücre proliferasyonu ve göçlerini ölçmek ve analiz etmek için fare böbreklerinden izole edilmiş tek kapsüllü glomeruli kullanarak bir ex vivo tayini geliştirmiştir. Bu yöntem parietal epitel hücre spesifik etkilerini belirlememize ve parietal epitel hücre aktivasyonu ve bu aktivasyonu inhibe etmek için test tedavi seçenekleri için sorumlu yollar bulmamızı sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede açıklanan protokolü kullanarak, parietal epitel hücre aktivasyonunun bir sonucu olan parietal epitel hücre proliferasyonunu değerlendirmek için tek kapsüllü glomeruli kullanabilirsiniz. Bu ex vivo modeli, parietal epitel hücre aktivasyonunda rol oynayan moleküler yolları ayrıntılı olarak incelememizi sağlayacaktır. Açıklanan yöntem, glomeruli kapsüllü glomeruli izole etmek ve kültür ve farklı deneysel koşullar altında parietal epitel hücrelerinin çoğalması ve / veya göç karş?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Hollanda Böbrek Vakfı (grant 14A3D104) ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO VIDI hibe: 016.156.363) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
