Glomerular Outgrowth كما مُجرا السابق Vivo لتحليل المسارات المشاركة في تنشيط الخلية الظهارية Parietal
Summary
توضح هذه المقالة طريقة لاستزراع وتحليل الخلايا الظهارية الكبيبية خارج الخلايا المغلفة من glomeruli معزولة عن الكلى الماوس. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة المسارات التي ينطوي عليها انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة.
Abstract
تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية (PEC) هو أحد العوامل الرئيسية التي تشارك في تطوير وتطور تصلب الكبيمرتولوس. وبالتالي فإن تثبيط المسارات التي تشارك في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية يمكن أن يكون أداة لتكبيل تطور الأمراض الكبية. توضح هذه المقالة طريقة للثقافة وتحليل الخلايا الظهارية الجدارية خارج من كبيبات مغلفة معزولة من الكلى الماوس. بعد تشريح الكلى الماوس المعزولة ، يتم سلخ الأنسجة ، ويتم عزل الجلاميرولي عن طريق الغربلة. يتم جمع glomeruli مغلفة، ويتم استزراع glomeruli واحد لمدة 6 أيام للحصول على الخروج الكبيّة من الخلايا الظهارية الجدارية. خلال هذه الفترة، يمكن تحليل انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة عن طريق تحديد عدد الخلايا أو المساحة السطحية للخلايا التي تتكاثر. وبالتالي يمكن استخدام هذا الفحص كأداة لدراسة آثار التعبير الجيني المتغير في الفئران المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب أو آثار ظروف الثقافة على خصائص نمو الخلايا الظهارية الجدارية والإشارة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن دراسة مسارات مهمة تشارك في عملية تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية وبالتالي في glomerulosclerosis.
Introduction
الأمراض الكبوية هي مجموعة هامة من اضطرابات الكلى وتمثل سببا رئيسيا للمرض الكلوي المرحلة النهائية (ESRD). لسوء الحظ، خيارات العلاج المحددة محدودة والتقدم إلى ESRD أمر لا مفر منه. يتم تعريف الأمراض الكبوية من خلال وجود إصابة glomerular ويمكن تجميعها في الأمراض الالتهابية وغير الالتهابية. على الرغم من أن الإهانة الأولية مختلفة ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الآلية الخلوية الشائعة تؤدي إلى تضخم الخلايا الظهارية الكبيّة وفي النهاية إلى تصلب الكبيات في جميع الأمراض الكبيات ، بغض النظر عن السبب الأساسي1،2،3،4.
على وجه التحديد، فقد تبين أن الآفات الكبيبية تتكون أساسا من الخلايا الظهارية الجدارية تنشيط5،6. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكون الخلايا الظهارية الجدارية خلايا ظهارية مسطحة هادئة تصطف كبسولة بومان من الجلجوميول. ومع ذلك، فإن أي إصابة الكبيّة إما بسبب الطفرات الوراثية (على سبيل المثال، podocyte محددة أو اعتلالات الميتوكوندريا)، أو الالتهاب أو فرط الترشيح (على سبيل المثال، الناجم عن انخفاض كتلة الكلى، وارتفاع ضغط الدم، والسمنة أو داء السكري) يمكن أن تؤدي إلى تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية. تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية تتكاثر و تودع مصفوفة خارج الخلية مما يؤدي إلى تكوين الهلال الخلوي أو الآفات الصلبة5,7,8. يؤدي تطور هذه العمليات إلى فقدان وظائف الكلى9. ولذلك، تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية هو عامل رئيسي في تطور وتطور glomerulosclerosis في كل من الأمراض الكبياتية الالتهابية وغير الالتهابية1،2،3،4،10.
والعمليات الجزيئية التي تتوسط في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وتظهر الدراسات الحديثة أن تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية دي نوفو أعرب CD44, مستقبلات التي هي مهمة لتفعيل مسارات مختلفة تشارك في انتشار الخلوية والهجرة. وعلاوة على ذلك، تم إظهار تثبيط CD44 لمنع تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية و الحد من تطور تشكيل الهلال و glomerulosclerosis في النماذج الحيوانية من الأمراض الكبيبية غير الالتهابية وكذلك11،12.
كما تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية هو لاعب رئيسي لتطوير glomerulosclerosis وتشكيل الهلال، تثبيط هذه الخلايا يمكن أن تبطئ تطور الأمراض الكبيات. قد يؤدي توضيح المسارات الجزيئية التي تقود تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية إلى تطوير تدخلات علاجية محددة تُعَطَّن تكوين الآفات الخافتة بالضمير الكيسي وتكبيبات الدم في الأمراض الكبيات.
في النماذج الحيوانية التجريبية، من الصعب في كثير من الأحيان تقديم أدلة على التأثير المباشر للتعبير الجيني المتغير (نماذج الماوس الناتجة عن الماوس أو نماذج الماوس المعدلة وراثيا) أو العلاج من المخدرات على الخلايا الظهارية الجدارية. في الماوس خروج المغلوب التقليدية لوحظ في التغيرات الجسمية يمكن تفسيرها من خلال التغيرات المباشرة في الخلايا الظهارية الجدارية. ومع ذلك، بما أن التعبير الجيني قد تغير أيضاً في أنواع الخلايا الأخرى داخل الماوس، فلا يمكن استبعاد الآثار غير المباشرة التي تتوسط فيها أنواع الخلايا الأخرى. وقد وفرت تطوير الفئران كري لوكس المشروطة التي يقودها المروجين النشطة أساسا في الخلايا الظهارية الجداري حلا في بعض الحالات13. ومع ذلك، فإن النماذج المعدلة وراثيا المشروطة معقدة، وعلى الرغم من أن هناك خطوطا أكثر مشروطا تصبح متاحة، فإن العديد من خطوط الماوس التقليدية أو الماوس المعدلة وراثيا لا يوجد بعد بديل مشروط.
لدراسة الآثار المباشرة على الخلايا الظهارية الجدارية، وقد وضعت مجموعتنا مقايسة الجسم الحي السابق باستخدام كبيبات مغلفة واحدة معزولة عن الكلى الماوس لقياس وتحليل انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة. هذه الطريقة سوف تمكننا من تحديد الآثار الخاصة بالخلايا الظهارية الجدارية والعثور على مسارات مسؤولة لتنشيط الخلايا الظهارية الجدارية وخيارات العلاج الاختبار لمنع هذا التنشيط.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام البروتوكول الموضح في هذه المقالة، يمكن للمرء استخدام كبيبات مغلفة واحدة لتقييم انتشار الخلايا الظهارية الجدارية التي هي نتيجة لتنشيط خلية الظهارية الجدارية. هذا النموذج السابق vivo سوف تمكننا من دراسة مفصلة المسارات الجزيئية، والتي تشارك في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية. تعتم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة الكلى الهولندية (منحة 14A3D104) والمنظمة الهولندية للبحث العلمي (منحة NWO VIDI: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
