Summary

Пневмококк инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке

Published: October 31, 2019
doi:

Summary

Это исследование описывает микроскопический мониторинг пневмококка соблюдения фон Willebrand фактор строки, производимые на поверхности дифференцированных человеческих первичных эндотелиальных клеток под сдвига стресс в определенных условиях потока. Этот протокол может быть расширен до детальной визуализации конкретных клеточных структур и количественной оценки бактерий путем применения дифференциальных иммуностоинных процедур.

Abstract

Взаимодействие стрептококковой пневмонии с поверхностью эндотелиальных клеток опосредовано в кровотоке через механочувствительные белки, такие как фактор фон Виллебранд (VWF). Этот гликопротеин изменяет свою молекулярную конформацию в ответ на стресс сдвига, тем самым подвергая обязательные участки для широкого спектра взаимодействий хозяина-лигада. В целом, культивирование первичных эндотелиальных клеток под определенным потоком сдвига, как известно, способствует специфической клеточной дифференциации и образованию стабильного и тесно связанного эндотелиального слоя, напоминающего физиологию внутренней слизистой оболочки кровеносных сосудов . Таким образом, функциональный анализ взаимодействий между бактериальными патогенами и сосудами-хозяевами с использованием механочувствительных белков требует создания насосных систем, которые могут имитировать физиологические силы потока, которые, как известно, влияют на поверхность сосудистых клеток.

Микрофлюидическое устройство, используемое в данном исследовании, обеспечивает непрерывную и бесприсрадаемую рециркуляцию жидкостей с определенной скоростью потока. Компьютерная система насоса воздушного давления применяет определенный стресс сдвига на эндотелиальных поверхностях клеток, генерируя непрерывный, однонаправленный и контролируемый средний поток. Морфологические изменения клеток и бактериальной привязанности могут микроскопически контролироваться и количественно в потоке с помощью специальных слайдов канала, которые предназначены для микроскопической визуализации. В отличие от инфекции культуры статических клеток, которая в целом требует фиксации образца до иммунной маркировки и микроскопических анализов, микрофлюидные слайды позволяют как флуоресценции на основе обнаружения белков, бактерий и клеточных компонентов после фиксации образца; серийное окрашивание иммунофлуоресценции; и прямое обнаружение на основе флуоресценции в режиме реального времени. В сочетании с флуоресцентными бактериями и специфическими флуоресценцией помечены антитела, эта процедура инфекции обеспечивает эффективную систему визуализации нескольких компонентов для огромного спектра научных приложений, связанных с сосудистыми процессами.

Introduction

Патогенез пневмококковых инфекций характеризуется многогранным взаимодействием с разнообразием внеклеточных матричных соединений и компонентов гемостаза человека, таких как плазминоген и VWF1, 3,4,5,6,7,8. Мультидоменглиновая гликопротеина VWF служит ключевым регулятором сбалансированного гемостаза путем посредничества в наборе тромбоцитов и инкорпорации фибрина в месте образования сосудистого тромба9. Важность функционального, активного VWF для контроля кровотечения и заживления ран демонстрируетболезнь фон Виллебранд, распространенное наследственное кровотечение10.

Глобулярный VWF циркулирует в крови человека в концентрации до 14,0 мкг/мл11,10. В ответ на сосудистые травмы, локальный выпуск VWF эндотелиальных тел Вейбель Паладе (WBP) заметно увеличилось11,12. Предыдущие исследования показывают, что пневмококк приверженность человека эндотелиальных клеток и его производство порообразующего токсина пневмолиза значительно стимулирует светлую секрецию VWF13. Гидродинамические силы кровотока вызывают структурное открытие механоответственных доменов VWF. При норме потока 10 dyn/cm2 VWF мультимеризирует до длинных белковых струн длиной до нескольких сотен микрометров, которые остаются прикрепленными к субэндотелию10,12.

Чтобы понять функцию мультимеризированных струн VWF, генерируемых при стрессе сдвига при взаимодействии пневмококка с эндотелиальной поверхностью, был создан микрофлюидный подход к клеточной культуре. Использовалось микрофлюидное устройство с программно-управляемой системой насоса воздушного давления. Это позволило непрерывно, однонаправленное рециркуляции среды клеточной культуры с определенной скоростью потока. Таким образом, система применила определенный стресс сдвига на поверхности эндотелиальных клеток, которые оставались прикрепленными внутри специализированных слайдов канала. Этот подход позволил смоделировать силу сдвига в крови сосудистой системы человека, в которой строки VWF генерируются на дифференцированных эндотелиальных клетках при определенных постоянных условиях потока. Для этого эндотелиальные клетки культивировались в конкретных слайдах канала (см. Таблица материалов),которые были адаптированы для микроскопических анализов во время потока. Микрофлюидная насосная система обеспечивала высокоопределенную и контролируемую стрессовую ситуацию, необходимую для формирования расширенных струн VWF на сливочного эндотелиального клеточного слоя. После стимуляции VWF-секретации конфлентически выращенных человеческих пупочных клеток вены (HUVEC) гистаминовой добавкой, образование строки было вызвано применением сдвига стресс (я) 10 dyn/cm2. Стресс сдвига определяется как сила, действующая на клеточном слое. Он рассчитывается примерно в соответствии с Корниш и т.д. al.14 с уравнением 1:
Equation 1

В тех случаях, когда стресс сдвига в dyn/cm2, вязкость в (dyn)/cm2, h q half of высота канала, w й половина ширины канала, и й s flowrate в mL/min.

Результат уравнения 1 зависит от различных высот и ширины различных используемых слайдов (см. Таблица материалов). В этом исследовании был использован слайд канала Luer в 0,4 мкм, в результате чего коэффициент камерного слайда составил 131,6 (см. формулу 2).
Equation 2

Вискозность среды при 37 градусах Цельсия составляет 0,0072 дина/см2 и использовался стресс сдвига 10 dyn/cm2. Это привело к скорости потока 10,5 мл/мин (см. формулу 3).
Equation 3

Здесь подробно описана адаптация и продвижение процедуры культивирования микрофлюидных клеток с использованием однонаправленной системы ламинара для исследования и визуализации механизмов бактериальной инфекции в сосудистой системе хозяина. Поколение строк VWF на эндотелиальных слоях также может быть стимулировано с помощью других насосных систем, которые способны применять непрерывный и устойчивый стресс сдвига15.

После культивирования первичных эндотелиальных клеток для слияния в потоке и стимуляции формирования струнных VWF, пневмококки, выражающие красный флуоресценционный белок (RFP)16 были добавлены в эндотелиальный клеточный слой под постоянным микроскопическим контролем. Привязка бактерий к струнам VWF на поверхности эндотелиальных клеток была микроскопически визуализирована и контролироваться в течение трех часов в режиме реального времени с помощью флуоресцентных антител, маркированных VWF. При таком подходе, роль VWF как кофактор адгезии содействия бактериальной привязанности к сосудистому эндотелия была определена8.

В дополнение к микроскопической визуализации секреции белка и конформационных изменений, этот метод может быть использован для мониторинга отдельных шагов процессов бактериальной инфекции в режиме реального времени и количественное количество прикрепленных бактерий в разных точках времени Инфекции. Специфическая система насоса, управляемая программным обеспечением, также обеспечивает возможность культуры эндотелиальных ячеек в определенных условиях постоянного потока на срок до нескольких дней и обеспечивает определенную инкубацию импульсного среднего потока. Кроме того, этот метод может быть применен с использованием различных типов клеток. Адаптация протокола окрашивания также позволяет обнаруживать и визуализировать бактерии, интернализированные в эукариотические клетки.

Данная рукопись описывает этот передовой экспериментальный протокол, который может быть использован в качестве определенного, надежного и воспроизводимого подхода для эффективной и универсальной характеристики патофизиологических процессов.

Protocol

Микрофлюидная культивация клеток осуществлялась с помощью коммерческих первичных эндотелиальных клеток пуповины человека (HUVEC). Компания изолировала клетки с информированным согласием донора. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Doctors Chamber федеративного государства Баде…

Representative Results

Культирование первичного HUVEC в постоянном однонаправленном потоке приводит к образованию сливательного и плотно упакованного клеточного слоя, который способствует генерации клеточных WPB, наполненных механочувствительным VWF13,14. Этот протокол описывает…

Discussion

Моделирование бактериального взаимодействия с механочувствительными белками-хостами, такими как VWF, требует сложной системы культуры клеток, которая позволяет генерировать определенный, однонаправленный и непрерывный поток жидкостей, тем самым создавая надежный стресс сдвига . Уже ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Проект финансировался DFG (BE 4570/4-1) в S.B.

Materials

1 mL Luer-syringe Fisher Scientific 10303002 with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe Sarstedt 9077136 For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase eBioscience now thermo fisher 00-4555-56 protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin Abcam ab176751 no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µl of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody Thermo Fisher Sientific A11001 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody Thermo Fisher Scientific A-11011 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth Becton Dickinson GmbH BD 249210 complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-25G solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter TPP 90026 subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R Beckman Coulter Life Sciences 392304 spinning down of bacteria (volumes of > 2mL)
Centrifuge Allegra X-30 Beckman Coulter Life Sciences B06314 spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK Hermle 305.00 V05 – Z 216 M spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3886.2 used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing ibidi 10821 for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator Fisher Scientific MIDI 40 incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37°C and 5% CO2
CO2-Incubator Sanyo MCO-18 AIC for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37°C
Colombia blood agar plates Becton Dickinson GmbH PA-254005.06 agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer Dell Latitude 3440 Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) Leica DMi8 An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3904.1 used for PBS buffer
Drying material Merck 101969 orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix Promocell C-39215 supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 µg / mL heparin, 1 µg / mL Hydrocortisone
ECGMS Promocell C-22010 ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) Promocell C-22010 culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS) biochrome now Merck S 0415 supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody Abcam ab8822 stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit ibidi 10903 fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G-1890-100g for precoating of microslide channel surface
histamine dihydrochloride Sigma Aldrich H-7250-10MG for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Promocell C-12203 Lot-Nr. 396Z042 primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) Santa Cruz sc73268 stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port ibidi 10820 for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope Zeiss Axiovert 35M inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) ibidi 80176 physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) Sigma Aldrich M7506-500G For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump ibidi 10905 air pressure pump
Neubauer cell counting chamber Karl Hecht GmbH&Co KG 40442002 microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710-S for cross linking of samples
Perfusion Set ibidi 10964 Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37°C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS) the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes Sarstedt 67,741 (2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum Pineda raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 6781.1 used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) ibidi v1.5.4 Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
reaction tubes 1.5/ 2.0mL Sarstedt 72.706/ 72.695.500 required for antibody dilutions
reaction tubes with 50 mL volume Sarstedt 6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci National Collection of Type Cultures, Public Health England 10,319 Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
serological pipets 5, 10 mL Sarstedt 86.1253.025/ 86.1254.025 for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) Sigma Aldrich 451614-25G for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe P030.2 used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22 Biochrom 80-2115-20 measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose Sigma Aldrich S0389-500G for preparation of blocking buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-500ML Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract oxoid LP0021 bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

References

  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. . Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , (2005).
  29. Shaw, J. A., Shaw, A. J. . Epithelial cell culture- a practical approach. , 218 (1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

Play Video

Cite This Article
Jagau, H., Behrens, I., Steinert, M., Bergmann, S. Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow. J. Vis. Exp. (152), e60323, doi:10.3791/60323 (2019).

View Video