Infezione da pneumococco delle cellule primarie endoteliali nel flusso costante
Summary
Questo studio descrive il monitoraggio microscopico dell’aderenza allo pneumococco alle stringhe del fattore von Willebrand prodotte sulla superficie di cellule endoteliali primarie umane differenziate sotto stress da taglio in condizioni di flusso definite. Questo protocollo può essere esteso alla visualizzazione dettagliata di specifiche strutture cellulari e alla quantificazione dei batteri applicando procedure di immunostaining differenziale.
Abstract
L’interazione di Streptococcus pneumoniae con la superficie delle cellule endoteliali è mediata nel flusso sanguigno attraverso proteine meccanosensibili come il Von Willebrand Factor (VWF). Questa glicoproteina cambia la sua conformazione molecolare in risposta allo stress da taglio, esponendo così i siti di legame per un ampio spettro di interazioni ospite-ligando. In generale, la coltura delle cellule endoteliche primarie sotto un flusso di taglio definito è nota per promuovere la differenziazione cellulare specifica e la formazione di uno strato endoteliale stabile e strettamente collegato simile alla fisiologia del rivestimento interno di un vaso sanguigno . Pertanto, l’analisi funzionale delle interazioni tra patogeni batterici e la vascolatura ospite che coinvolge proteine meccanosensibili richiede l’istituzione di sistemi di pompaggio in grado di simulare le forze di flusso fisiologico note per influenzare la superficie cellule vascolari.
Il dispositivo microfluidico utilizzato in questo studio consente un ricircolo continuo e senza impulsi dei fluidi con una portata definita. Il sistema di pompaggio a pressione dell’aria controllato dal computer applica una sollecitazione di taglio definita sulle superfici delle cellule endote generando un flusso medio continuo, unidirezionale e controllato. I cambiamenti morfologici delle cellule e dell’attaccamento batterico possono essere monitorati e quantificati al microscopio nel flusso utilizzando speciali vetrini di canale progettati per la visualizzazione microscopica. A differenza dell’infezione da coltura cellulare statica, che in generale richiede una fissazione del campione prima dell’etichettatura immunitaria e delle analisi microscopiche, i vetrini microfluidici consentono sia il rilevamento basato sulla fluorescenza di proteine, batteri e componenti cellulari dopo la fissazione del campione; colorazione dell’immunofluorescenza seriale; e rilevamento diretto basato sulla fluorescenza in tempo reale. In combinazione con batteri fluorescenti e anticorpi specifici con etichettatura a fluorescenza, questa procedura di infezione fornisce un efficiente sistema di visualizzazione di componenti multipli per un enorme spettro di applicazioni scientifiche relative ai processi vascolari.
Introduction
La patogenesi delle infezioni da pneumococco è caratterizzata da un’interazione sfaccettata con una diversità di composti di matrice extracellulare e componenti dell’emostasi umana, come plasminogen e VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. La VWF glicoproteina multidominio funge da regolatore chiave di un’emostasi bilanciata mediando il reclutamento di trombociti e l’incorporazione di fibrina nel sito di formazione di trombosi vascolare9. L’importanza del VWF funzionale e attivo per il controllo delle emorragie e la guarigione delle ferite è dimostrata dalla malattia di von Willebrand, un comune disturbo ereditario del sanguinamento10.
Il VWF globulare circola nel sistema sanguigno umano ad una concentrazione fino a 14,0 g/mL11,10. In risposta alle lesioni vascolari, il rilascio locale di VWF da parte di Weibel Palade Bodies (WBP) endoteliale è notevolmente aumentatodi 11,12. Studi precedenti dimostrano che l’aderenza allo pneumococco alle cellule endoteliali umane e la sua produzione della pneumolysin tossina che formano i pori stimola noannamente la secrezione VWF luminale13. Le forze idrodinamiche del flusso sanguigno inducono un’apertura strutturale dei domini VWF meccanorenti. Con una portata di 10 dyn/cm2 il VWF si multimerisce a lunghe stringhe proteiche fino a diverse centinaia di micrometri di lunghezza che rimangono attaccate al subendotelio10,12.
Per comprendere la funzione delle stringhe VWF multimeriche generate sotto stress da taglio nell’interazione dello pneumococco con la superficie endoteliale, è stato stabilito un approccio di infezione da coltura cellulare basato su microfluidica. È stato utilizzato un dispositivo microfluidico con un sistema di pompa a pressione dell’aria controllato dal software. Ciò ha permesso un continuo, unidirezionale ricircolo del mezzo di coltura cellulare con una portata definita. Di conseguenza, il sistema ha applicato una sollecitazione di taglio definita sulla superficie delle cellule endoteliali, che sono rimaste attaccate all’interno di vetrini di canale specializzati. Questo approccio ha permesso la simulazione della forza di taglio all’interno del flusso sanguigno del sistema vascolare umano, in cui le stringhe VWF vengono generate su cellule endoteliali differenziate in condizioni di flusso costante definite. A tale scopo, le cellule endoteliali sono state coltivate in specifici vetrini di canale (vedi Tabella dei materiali), che sono stati adattati per analisi microscopiche durante il flusso. Il sistema di pompaggio microfluidico ha fornito la situazione di sollecitazione di taglio altamente definita e controllata necessaria per la formazione di corde VWF estese sullo strato di cellule endoteliali confluenti. Dopo la stimolazione della secrezione di VWF delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) coltivate confluentemente dal completamento dell’istamina, la formazione delle corde è stata indotta applicando uno stress da taglio di 10 disiniettorio2. La sollecitazione di taglio è definita come la forza che agisce sul livello della cella. Viene calcolato approssimativamente secondo Cornish et. al.14 con l’equazione 1:
Dove , e lo stress da taglio in dyn/cm2, la viscosità (dyn s)/cm2, h , la metà dell’altezza del canale, la larghezza del canale e la metà della larghezza del canale e la linea di flusso in mL/min.
Il risultato dell’equazione 1 dipende dalle diverse altezze e larghezze delle diverse diapositive utilizzate (vedere Tabella dei materiali). In questo studio è stata utilizzata una diapositiva di canale Luer di 0,4 m risultante in un fattore di scorrimento della camera di 131,6 (vedere la formula 2).
La viscosità del mezzo a 37 gradi centigradi è 0,0072 dynos/cm2 ed è stata utilizzata una sollecitazione di taglio di 10 dini/cm2. Ciò ha comportato una portata di 10,5 mL/min (vedi formula 3).
Qui, l’adattamento e l’avanzamento di una procedura di coltura cellulare microfluidica utilizzando un sistema di flusso laminare unidirezionale per l’indagine e la visualizzazione dei meccanismi di infezione batterica nella vascolatura ospite è descritto in dettaglio. La generazione di stringhe VWF su strati endoteliali può essere stimolata anche utilizzando altri sistemi di pompaggio in grado di applicare una sollecitazione di taglio continua e costante15.
Dopo la coltivazione di cellule endoteliali primarie alla confluenza nel flusso e nella stimolazione della formazione delle corde VWF, gli pneumococci che esprimono la proteina di fluorescenza rossa (RFP)16 sono stati aggiunti allo strato di cellule endoteliali sotto costante controllo microscopico. L’attaccamento dei batteri alle stringhe VWF sulla superficie delle cellule endoteliali è stato visualizzato e monitorato al microscopio per un massimo di tre ore in tempo reale utilizzando anticorpi con etichettafluenza specifica VWF. Con questo approccio, il ruolo del VWF come cofattore di adesione che promuove l’attaccamento batterico all’endotelio vascolare è stato determinato8.
Oltre alla visualizzazione microscopica della secrezione proteica e ai cambiamenti conformazionali, questo metodo potrebbe essere utilizzato per monitorare singoli passaggi dei processi di infezione batterica in tempo reale e per quantificare la quantità di batteri collegati in diversi punti temporali di infezione. Lo specifico sistema di pompe software-controllato offre anche la possibilità di coltura le cellule endoteliali in condizioni di flusso costante definite per un massimo di diversi giorni e consente un’incubazione a flusso medio pulsato definito. Inoltre, questo metodo può essere applicato utilizzando diversi tipi di cella. L’adattamento del protocollo di colorazione consente anche il rilevamento e la visualizzazione di batteri interiorizzati in cellule eucariotiche.
Questo manoscritto descrive questo protocollo sperimentale avanzato che può essere utilizzato come approccio definito, affidabile e riproducibile per una caratterizzazione efficiente e versatile dei processi patofisiologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
La simulazione dell’interazione batterica con proteine ospiti meccanosensibili come VWF richiede un sistema di coltura cellulare perffubile che consente la generazione di un flusso definito, unidirezionale e continuo di liquidi, generando così uno stress di taglio affidabile . Sono già stati descritti diversi sistemi di pompe microfluidiche. Una revisione completa di Bergmann et al. riassume gli aspetti chiave dei diversi modelli di coltura cellulare bidimensionali e tridimensionali17.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto è stato finanziato dal DFG (BE 4570/4-1) a S.B.
Materials
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µl of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of > 2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 – Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37°C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37°C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 µg / mL heparin, 1 µg / mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37°C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| reaction tubes 1.5/ 2.0mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
References
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