La conservazione delle cozze d’acqua dolce dipende dal monitoraggio dei modelli riproduttivi e dei processi delle specie. Questo studio standardizza un protocollo non letale per il campionamento del contenuto branchiale, la caratterizzazione dello sviluppo larvale e la fornitura di un archivio digitale per i dati raccolti. Questo pacchetto di database di protocollo sarà uno strumento importante per i ricercatori di cozze nel recupero delle specie in pericolo.
Il monitoraggio attivo dei tempi, dello sviluppo e dei modelli riproduttivi delle specie in via di estinzione è fondamentale quando si gestisce il recupero della popolazione. Le cozze d’acqua dolce sono tra gli organismi più in pericolo al mondo, ma le informazioni sullo sviluppo precoce (glochidico) e sui periodi di cova sono ancora carenti per molte specie. Studi precedenti si sono concentrati sulla complessa fase della storia della vita in cui le cozze femminili sono pronte a parassitizzare i pesci ospiti, ma pochi studi si sono concentrati sul periodo di rimuginare e sui tempi dello sviluppo larvale. Il protocollo qui descritto consente ai ricercatori di valutare in modo non letale lo stato di gravidità delle cozze femminili. I risultati di questo studio mostrano che questo metodo non influisce sulla capacità di una cozza femminile di rimanere gravida o diventare gravitadi di nuovo dopo che il campionamento è stato eseguito. Il vantaggio di questo metodo può consentire il suo utilizzo su specie minacciate a livello federale o in via di estinzione o altre popolazioni di elevata preoccupazione per la conservazione. Questo protocollo può essere adattato per l’uso sia su individui conservati che vivi ed è stato testato su una varietà di specie di cozze. Il database fornito è un deposito per una vasta gamma di informazioni sui tempi delle abitudini riproduttive e faciliterà i futuri sforzi di ricerca, conservazione e recupero delle cozze d’acqua dolce.
La persistenza delle popolazioni nei sistemi di acqua dolce dipende dal successo della riproduzione e del reclutamento. Per gli organismi parassiti, identificare la complessità del ciclo di vita (ad esempio, fasi dello sviluppo larvale e strategie di attrazione ospite) può dare una visione delle abitudini riproduttive e dei processi critici di un organismo che influenzano il reclutamento. Tali informazioni diventano importanti quando le specie sono in pericolo, e il reclutamento di successo è necessario per sostenere le popolazioni rimanenti, o se il recupero richiede l’uso di propagazione in cattività per ristabilire le popolazioni estirpate.
Le cozze d’acqua dolce (Bivalvia: Unionida) sono considerate uno dei gruppi di organismi più in pericolo al mondo e una raccolta di abitudini riproduttive specifiche per specie potrebbe aiutare negli sforzi di ricerca1,2,3 ,4,5. Con oltre 800 specie attualmente riconosciute distribuite in tutto il mondo, le cozze d’acqua dolce hanno punti caldi di diversità in Nord e Sud America, e nell’Asia sudorientale, ma le informazioni essenziali sulla storia della vita sono sconosciute a molte specie2, 5,6,7. Le famiglie all’interno di questo ordine sono caratterizzate da stadi larvali parassitari che completano la metamorfosi in giovani viventi liberi durante l’attaccamento ad un ospite7,8. Questa fase unica della storia della vita contribuisce alla biodiversità nei sistemi di acqua dolce, che sono attualmente in crisi9. Alti livelli di pericolo possono essere attribuiti a molte minacce antropogeniche tra cui l’inquinamento dei corsi d’acqua, l’alterazione e la distruzione dell’habitat, la riduzione dell’abbondanza e della diversità dei pesci ospiti e l’introduzione di specie invasive1, 10. Come alimentatori di filtri bentici, le cozze scavano nel substrato e sono sensibili a contaminanti e inquinanti che drenano nello spartiacque11. Il recupero delle specie di cozze è pertinente in quanto forniscono un’ampia varietà di servizi ecosistemici, tra cui il sequestro del carbonio, una fonte alimentare e la purificazione dell’acqua mediante l’alimentazione filtrata11. Inoltre, sono state trovate cozze per indicare la salute dell’ecosistema, promuovere la biodiversità e, a sua volta, aumentare la resilienza di un ecosistema12.
Molti studi sulle cozze d’acqua dolce si sono concentrati sullo studio dei requisiti di storia della vita precoce per informare meglio le valutazioni dello stato delle specie e le strategie di gestione. Le famiglie di cozze d’acqua dolce rilevanti per questo studio (ad esempio, Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) hanno una strategia unica di storia della vita in cui le femmine covano larve (glochidia) nella loro branchia marsupiale8. Attraverso una varietà di strategie, la cozza femminile espelle la glochidia matura dalle branchie marsupiali per parassitare un ospite vertebrato con glochidia13. La ricerca sullo sviluppo glochidico all’interno delle branchie è stata modificata da una tecnica che utilizza siringhe ipodermiche per campionare il liquido gonadale dalle cozze vive e valutare la produzione di gameti14,15,16. Poiché i ricercatori hanno convalidato questa metodologia non letale per il campionamento delle gonadi, è stata adattata per il campionamento delle branchie marsupiali per valutare lo sviluppo della covata15,16. Lo sviluppo della covata può essere usato per decifrare le relazioni filogenetiche in quanto alcune specie di cozze possono covare la glochidia solo nelle due branche esterne (ectobranchus), solo le due branchie interne (endobranchus), o in tutte e quattro le branchie (tetrabranchus), ma questa caratteristica non è nota per ogni specie17. I modelli di cova sono stati precedentemente utilizzati per classificare le specie di cozze in base al fatto che le cozze femmina cotracciano la glochidia durante l’inverno (bradytictic) o per un breve periodo in estate (tatticica)18. Lo svernamento delle covate di cozze è stato sostenuto quando il ciclo riproduttivo di Anodonta è stato studiato19. Tuttavia, la biologia riproduttiva di base è stata studiata più a fondo nel corso degli anni e ha scoperto che questa dicotomia era una grossolana generalizzazione e i periodi di meditabondo di alcune specie sono molto più complessi di quanto originariamente si presumesse20,21. Ad esempio, le specie del genere Hyridella (famiglia Hyriidae), Glebula e Elliptio (famiglia Unionidae) sono state osservate con più di tre nidiate per stagione riproduttiva22,23, 24. La complessità delle abitudini di produzione specifiche delle specie, e talvolta anche dellapopolazione,ha portato a una lacuna nella conoscenza dei tempi e della durata della covata e del numero di nidiate che una cozza femmina può produrre.
Anche se le siringhe ipodermiche sono state utilizzate per estrarre il contenuto branchiale, riportare i risultati è complicato a causa della mancanza di standardizzazione per garantire risultati comparabili in tutti gli studi. In precedenza, quattro stadi di sviluppo della glochidia (ad esempio, ovuli, embrioni, immaturi, completamente sviluppati) sono stati identificati in Unionidae, ma non sono stati adottati nella procedura standard16,25,26. Altri studi che osservano i membri di Margaritiferidae hanno sostituito la classificazione della “glochidia immatura” con ‘sviluppo della glochidia’, portando a potenziale confusione27,28. La mancanza di coerenza nel caratterizzare le diverse fasi di sviluppo larvale ha lasciato molti ricercatori a descrivere generalmente le femmine rimuginanti come “gravid”, che non comprende la complessità dello sviluppo larvale. Studi sulla storia della vita che conducono sperimentazioni di pesci ospiti hanno dato priorità alla necessità di femmine gravid con glochidia completamente sviluppata, ma queste informazioni sono sparse in tutta la letteratura pubblicata e inedita29,30. Attualmente, mancano dati sulle abitudini riproduttive di molte specie di cozze, tra cui la tempistica della transizione tra uovo, glochidia immatura e glochidia completamente sviluppata pronta per l’attaccamento agli ospiti. Per la maggior parte delle specie, non è chiaro per quanto tempo le femmine covano glochidia e quanto rapidamente le uova fecondate si sviluppano completamente. Le lacune di conoscenza sono spesso più ampie per le specie di interesse per la conservazione, il che presenta la necessità di un metodo standardizzato per estrarre il contenuto branchiale che è stato testato per gli effetti non letali e può essere promosso alla comunità scientifica per integrare metodologie di raccolta dati tradizionali, senza rappresentare una minaccia per le popolazioni protette24,31,32.
Questo studio aveva tre obiettivi: 1) formalizzare una tecnica di campionamento branchiale e testarla per gli effetti letali e non letali sulle cozze femminili in situ, 2) caratterizzare le diverse fasi dello sviluppo glochidico e descrivere un metodo standardizzato di identificazione e segnalando varie fasi larvali, e 3) creare un archivio pubblico per i dati raccolti. Le indagini sul campo, i progetti di monitoraggio a lungo termine e le collezioni museali rappresentano tutte opportunità per l’attuazione del protocollo qui descritto e la raccolta di dati aggiuntivi per un più ampio ambito di interesse. Il protocollo formalizzato include immagini e descrizioni dei caratteri per differenziare ogni fase dello sviluppo larvale. Standardizzando le categorie, i risultati raccolti possono essere confrontati tra tutte le occorrenze e le specie. Una volta raccolti i dati, tutti possono essere presentati al Freshwater Mussel Gravidity Almanac (FMGA), che è un database per le informazioni sulla gravidità raccolte utilizzando questo protocollo. Un prodotto finale per memorizzare e compilare tutte le informazioni sulla gravidità raccolte fornirà uno strumento di ricerca per facilitare i futuri sforzi di ricerca, conservazione e recupero. L’incorporazione di questa metodologia in vari progetti di cozze e la presentazione di dati all’FMGA si espanderebbero sull’ampiezza delle conoscenze riguardanti lo stato di gravitismo delle specie di cozze durante tutto l’anno. Come un gruppo altamente in pericolo di organismi, questo protocollo e il database risultante sulle abitudini riproduttive delle cozze d’acqua dolce è essenziale per comprendere le dinamiche della popolazione e facilitare la conservazione di queste specie.
Significato
La conservazione delle specie in pericolo dipende dal successo del reclutamento all’interno delle popolazioni esistenti. In alcuni casi, la propagazione artificiale può essere necessaria per aumentare il reclutamento di queste popolazioni a rischio. Ciò richiede che i ricercatori siano informati sui tempi di riproduzione attiva per ogni specie ed eventualmente applichino diverse metodologie o pratiche di gestione per mitigare l’impatto sul reclutamento. Come gruppo di organismi in pericolo, è fondamentale stabilire un approccio standardizzato e non letale per studiare le abitudini riproduttive e fornire una piattaforma su cui compilare e visualizzare i dati per informare la comunità scientifica con le più aggiornate informazioni disponibili. Questo studio fornisce un protocollo passo-passo per garantire che vengano prese precauzioni, e il contenuto delle branchie può essere adeguatamente campionato e valutato da cozze femminili. Questo protocollo è stato testato per gli effetti letali e non letali, consentendo a i ricercatori e manager di implementare responsabilmente questa metodologia. Abbiamo inoltre sviluppato una suite di strumenti e applicazioni per la gestione dei database per facilitare la compilazione di informazioni sulla gravidità su un dashboard disponibile pubblicamente e di facile utilizzo. Gli studi sull’epidemiologia, la morfologia della glochidia, la storia della vita, la filogenetica, la propagazione e le traslocazioni possono tutti trarre beneficio e utilizzare questo archivio di informazioni sulla gravidità temporale per tutte le specie di cozze d’acqua dolce.
Questo studio da solo ha sostenuto i risultati di studi precedenti di alcune abitudini riproduttive delle specie, ma ha anche rivelato nuove informazioni su altre. Anche se V. vibex è stato raccolto in meno di V. lienosa, le somiglianze possono essere trovate tra i due sulla base dei dati di gravidità. Entrambe le specie di Villosa sembrano covare glochidia completamente sviluppato durante una gran parte dell’anno, che li caratterizza come una covata svernante. Questo è coerente con studi precedenti su altre specie di Villosa 43,44,45. I risultati di questo studio suggeriscono che H. australis può essere trovato gravid da ottobre e svernamento in giugno, tranne nessuna cattura sono stati trovati gravid nel mese di dicembre. Uno studio pubblicato in precedenza ha identificato il congene H. altilis con un periodo di gravidità di quattro mesi, da marzo agiugno 46,47. Questa scoperta illustra un periodo di gravidità più lungo di quanto si pensasse in precedenza e generalmente raggruppa H. australis come una covata svernante. Come specie protette a livello federale, diversi periodi di cova per H. altilis e H. australis potrebbero influenzare le decisioni di gestione per proteggere meglio le popolazioni durante i tempi di attività riproduttiva. Elliptio pullata sono stati trovati gravid solo con EGG in maggio e giugno che corrisponde alla loro caratterizzazione come una specie tachitica con un brevissimo periodo di cova24,48,49, 50. Poiché i dati vengono compilati sulle specie di Elliptio utilizzando questo protocollo, informazioni dettagliate possono rendere gli sforzi sul campo più efficienti quando determinate fasi di sviluppo glochidico sono mirate, poiché la glochidia si trovano solo pochi mesi all’anno. L’inferenza delle altre specie con dimensioni di campione più basse è limitata, ma man mano che i dati vengono compilati nella banca dati, dimensioni del campione più elevate daranno informazioni sulle abitudini riproduttive di altre specie di cozze.
Osservazioni procedurali
Le cozze d’acqua dolce e la loro glochidia sono noti per essere suscettibili a fattori di stress antropogenici10,35. Durante l’ispezione della gravidità, le valvole delle cozze potrebbero non essere facili da aprire e forzare con noncuranza le valvole aperte può causare danni involontari e provocare stress o mortalità. Alcune specie a conchiglia fragile (ad esempio, specie di Anodonta, Leptodea, Utterbackia,ecc.) e individui di dimensioni più piccole possono avere gusci molto fragili e muscoli adduttori deboli che possono rompersi e strapparsi facilmente. Il campionamento della branchia può essere considerato un fattore di stress se la manipolazione non viene eseguita in modo responsabile e con cautela. Uno studio precedente ha scoperto che la manipolazione e l’esposizione aerea delle cozze durante i periodi di attività riproduttiva possono causare vari stress fisiologici, tra cui il rilascio prematuro del contenutobranchiale 34. Tuttavia, uno studio che utilizza va su una metodologia simile a quella descritta qui, ha scoperto che la gestione delle cozze femminili gravidate durante il campionamento delle branchie non ha interrotto l’attuale covata o ha causato un rilascio prematuro sia nelle specie di covata a breve che a lungo termine16. Inoltre, una siringa sterile deve essere utilizzata durante questo protocollo per prevenire qualsiasi infezione involontaria o contaminazione incrociata quando si perforano branchie di più individui. Inoltre, la glochidia è fragile e le nidiate possono essere maturate e stressate ma non espulse. La glochidia matura in cattive condizioni di salute può portare a un minor numero di individui che reagiscono ai test del sale35. Quando si effettua la distinzione tra DG(T) e FDG(T) è importante testare il sale con un campione di grandi dimensioni, prendere nota sulle osservazioni per identificare attentamente le distinzioni tra DG e Glochidia FDG utilizzando le descrizioni fornite in questo studio. Quando si fa cura adeguata, lo stress minimo indotto da questa procedura può consentire alle cozze femminili di continuare a meditare la glochidia naturalmente e ridurre gli impatti sul reclutamento nella popolazione.
Ulteriori dati possono essere registrati per integrare il database e fornire un ampio contesto per le abitudini riproduttive delle cozze d’acqua dolce. Alcune specie (ad esempio, specie di Fusconaia), sono state osservate avere branchie di colori diversi in base allo stadio di sviluppo della glochidia51. Durante un controllo iniziale della gravità della femmina, una descrizione del colore branchiale può essere inclusa nei dati riportati per consentire indagini future. Inoltre, a questo punto del protocollo, i ricercatori possono notare se la femmina covata è stata trovata glochidia meditabonda nelle due branchie esterne (ectobranchus), due branchie interne (endobranchus), o tutte e quattro le branchie (tetragenhe)17. Queste informazioni possono essere aggiunte all’FMGA e aiutano a colmare le lacune di dati relative alla cova per ogni specie studiata. Le condizioni ambientali, in particolare la temperatura dell’acqua, possono essere raccolte e registrate sul campo per un’osservazione più completa dello stato di gravidità e dei tempi delle specie a varie gamme latitudinali. La ricerca mostra che i parametri ambientali, come la temperatura, il fotoperiodo, la portata e la disponibilità di cibo, possono indurre eventi riproduttivi nelle cozze d’acqua dolce52,53,54,55 ,56. Ulteriori campi possono essere aggiunti alla banca dati in quanto vengono presentati per promuovere la ricerca futura sui fattori abiotici che influenzano la gravità. Una modifica di cattura-mark-recapture modellata dopo il nostro studio può anche essere aggiunto a questo protocollo, che consentirebbe ai ricercatori di monitorare le abitudini riproduttive di una cozza specifica e rivelare informazioni su più nidiate all’anno.
L’accuratezza delle informazioni nell’FMGA dipende dalla fonte. Ad esempio, l’errata identificazione delle cozze d’acqua dolce è comune a causa di molte specie con caratteristiche esterne simili che rendono difficile distinguere tra le specie57. Un campione branchiale di un individuo non identificato in modo improprio potrebbe creare confusione e false informazioni per il periodo di cova di una specie. Se viene prelevato un campione branchiale, è necessario fotografare entrambe le valvole (se l’individuo non è vivo), all’esterno della valvola destra e l’umbo (cerniera dove si connettono due valvole) e inviarle con dati di gravidità attraverso il sito desktop o l’applicazione mobile. Accogliamo anche le foto dei contenuti branchiali. All’interno dei moduli di presentazione c’è un menu a discesa che consente al collettore di indicare il loro livello di confidenza per quanto riguarda l’identificazione delle specie. Prima che il record venga convalidato, queste informazioni saranno prese in considerazione quando si verifica l’identificazione del collettore rispetto alla distribuzione plausibile, ecc. A causa dell’elevato grado di variazione morfologica intraspecifica nelle specie di Unionidae, la presentazione di campioni di tessuto è incoraggiata e può essere necessaria per facilitare l’identificazione molecolare.
Implicazioni future
Come metodo non letale, questo protocollo può essere applicato sia alle specie comuni che a quella in pericolo. I calendari di gravità per le specie in pericolo possono aiutare i responsabili della conservazione coinvolti nella legislazione sulle specie in via di estinzione e nella pianificazione del recupero fornendo informazioni sui periodi di tempo in cui le specie sono riproduttivamente attive. Le agenzie statali e federali che gestiscono le specie a rischio possono consigliare meglio l’assegnazione dei permessi per i periodi in cui la specie non è vulnerabile e riproduttiva, e persino limitare la raccolta di pesci ospiti durante i periodi in cui le cozze stanno rimuginando glochidia completamente sviluppate. Inoltre, le indagini sul campo possono colpire le specie durante i periodi non riproduttivi per ridurre al minimo l’impatto sui processi di reclutamento. La banca dati accessibile al pubblico, FMGA, fornisce uno strumento per ricercatori e manager per ottenere importanti informazioni riproduttive su qualsiasi specie di cozze d’acqua dolce bersaglio. La banca dati metterà inoltre in evidenza le lacune nei dati, incoraggiando ulteriori ricerche sui modelli di cova specifici delle specie. Poiché la comprensione di un modello riproduttivo delle specie consente di attuare decisioni di gestione adeguate, ci auguriamo che il nostro protocollo e il nostro database facilitino la futura ricerca, conservazione e recupero delle cozze d’acqua dolce.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare le fonti di finanziamento: U.S. Fish and Wildlife Service e U.S. Geological Survey. Un ringraziamento speciale a Andrew Hartzog e Sandra Pursifull per l’organizzazione di equipaggi sul campo e la raccolta dei dati, insieme a Lauren Patterson e Chris Anderson per i loro preziosi contributi allo sviluppo di database. Vorremmo anche ringraziare tutti coloro che hanno aiutato nel campo e il laboratorio tra cui Sherry Bostick, Mark Cantrell, Sahale Casebolt, Jordan Holcomb, Howard Jelks, Gary Mahon, John McLeod, Kyle Moon, Cayla Morningstar, Emma Pistole, Matt Rowe, Channing St. Aubin, e Jim Williams. Qualsiasi uso di marchi, società o nomi di prodotto è solo a scopo descrittivo e non implica l’approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.
1.5 mL snap cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost. |
20 G needle on 10 mL disposable syringe | Exelint International | 26255 | sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2" |
Dissecting Microscope | any | any | |
Marking Pen | Fisher Scientific | 13-379-4 | This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof. |
Molecular grade ethanol | any | any | Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work. |
Paper | any | any | Needed to record information on samples collected. |
Pen/pencil | any | any | If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine. |
Petri dish | DWK Life Sciences (Kimble) | 23000-9050 | This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used. |
Sodium Chloride | any | any | Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this. |
Speculum | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |
Sterile water | any | any | Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection. |
Super glue | Gorilla | Gorilla super glue gel | Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
Tags | Hallprint | FPN 8×4 | Only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
Transfer Pipet | Thermo Scientific Samco | 225 | This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable. |
Tweezers | any | any | Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this. |
Waterproof paper | RainWriter | any | Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from. |
Wooden pick | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |