Het behoud van zoet water mossel is afhankelijk van het monitoren van voortplantings patronen en processen van soorten. Deze studie standaardiseert een niet-dodelijk protocol voor het bemonsteren van Gill-inhoud, het karakteriseren van de larvale ontwikkeling en het verstrekken van een digitale repository voor verzamelde gegevens. Dit protocol-database-pakket zal een belangrijk hulpmiddel zijn voor mossel onderzoekers die niet-verontreinigde soorten herstellen.
Het actief monitoren van de timing, ontwikkeling en voortplantings patronen van bedreigde diersoorten is van cruciaal belang bij het beheer voor populatie herstel. Zoetwatermosselen behoren tot de meest belaagde organismen in de wereld, maar informatie over vroege larvale (glochidial) ontwikkeling en broed perioden ontbreekt nog steeds voor vele soorten. Eerdere studies hebben zich geconcentreerd op de complexe levensgeschiedenis fase wanneer vrouwelijke mosselen klaar zijn om gastheer vis te parastiseren, maar weinig studies hebben zich gericht op de broedperiode en timing van de larvale ontwikkeling. Het hier beschreven protocol stelt onderzoekers in staat om de toestand van de graviiteit voor vrouwelijke mosselen niet-dodelijk te evalueren. De resultaten van deze studie tonen aan dat deze methode geen invloed heeft op het vermogen van een vrouwelijke Mossel om zwangere te blijven of na het bemonsteren opnieuw zwangere te worden. Het voordeel van deze methode kan het gebruik ervan mogelijk maken op door de federale staat bedreigde of bedreigde soorten of andere populaties met een hoog instandhoudings probleem. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik op zowel bewaarde als levende individuen en is getest op een verscheidenheid aan Mossel soorten. De verstrekte database is een opslagplaats voor een breed scala aan informatie over de timing van voortplantings gewoonten en zal toekomstig onderzoek naar zoet water Mossel, instandhouding en herstel inspanningen vergemakkelijken.
De persistentie van populaties in zoetwatersystemen hangt af van het succes van reproductie en rekrutering. Voor parasitaire organismen kan het identificeren van de fijne kneepjes van de levenscyclus (bv. stadia van larvale ontwikkeling en attractie strategieën voor de gastheer) inzicht geven in de voortplantings gewoonten van een organisme en kritische processen die de werving beïnvloeden. Dergelijke informatie wordt belangrijk wanneer soorten worden ondoorgetrokken en succesvolle rekrutering nodig is om de overblijvende populaties te ondersteunen, of als het herstel het gebruik van gevangenschap noodzakelijk maakt voor de heroprichting van uitgeroeid populaties.
Zoetwatermosselen (Bivalvia: unionida) worden beschouwd als een van de meest belaagde groepen van organismen wereldwijd en een compilatie van soortspecifieke voortplantings gewoonten kan helpen bij onderzoeksinspanningen1,2,3 ,4,5. Met meer dan 800 momenteel erkende soorten verdeeld over de hele wereld, hebben zoetwatermosselen hotspots van diversiteit in Noord-en Zuid-Amerika en Zuidoost-Azië, maar essentiële levensgeschiedenis informatie is onbekend voor vele soorten2, 5,6,7. Families binnen deze orde worden gekenmerkt door het hebben van parasitaire larvale stadia die metamorfose in vrij levende jonge exemplaren tijdens gehechtheid aan een gastheer7,8voltooien. Deze unieke levensgeschiedenis fase draagt bij aan de biodiversiteit in zoet watersystemen, die zich momenteel in crisis9bevinden. Hoge niveaus van imperilment kunnen worden toegeschreven aan vele antropogene dreigingen, waaronder vervuiling van waterwegen, wijziging van de habitat en vernietiging, vermindering van de overvloed en diversiteit van de gastheer vissen, en de introductie van invasieve soorten1, 10. Als benthische filter feeders worden mosselen in het substraat begraven en zijn ze vatbaar voor verontreinigingen en verontreinigende stoffen die in de waterscheiding11lopen. Terugwinning van Mossel soorten is relevant omdat ze een breed scala aan ecosysteemdiensten bieden, waaronder koolstofvastlegging, een voedselbron en waterzuivering door filter voeding11. Daarnaast zijn mosselen gevonden om ecosysteem gezondheid aan te duiden, biodiversiteit te bevorderen en op hun beurt de veerkracht van een ecosysteem12te verhogen.
Veel zoet water Mossel studies hebben zich geconcentreerd op het onderzoeken van vereisten voor vroege levensgeschiedenis om de soorten status beoordelingen en management strategieën beter te informeren. De families van zoet water Mossel die relevant zijn voor deze studie (bijvoorbeeld Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) hebben een unieke levensgeschiedenis strategie waar vrouwtjes broed larven (glochidia) in hun buideldieren8. Door middel van een verscheidenheid aan strategieën verdrijft de vrouwelijke Mossel rijpe glochidia van buideldieren om een gewervelde gastheer met glochidia13te parastiseren. Onderzoek naar de ontwikkeling van glochidial binnen de kieuwen werd gewijzigd van een techniek met behulp van hypodermische spuiten om gonadale vloeistof van levende mosselen te proeven en de productie van gameten evalueren14,15,16. Omdat onderzoekers deze niet-dodelijke methodologie voor gonaden-sampling hebben gevalideerd, werd het aangepast voor marsupiale Gill-bemonstering om broed ontwikkeling15,16te evalueren. Brood ontwikkeling kan worden gebruikt om fylogenetische relaties te ontcijferen, omdat sommige Mossel soorten glochidia alleen kunnen broeden in de buitenste twee kieuwen (ectobranchus), alleen de binnenste twee kieuwen (endobranchus) of in alle vier de kieuwen (tetrabranchus), maar dit kenmerk is niet bekend voor elke soort17. Broed patronen zijn eerder gebruikt om Mossel soorten te classificeren door vrouwelijke mosselen brood glochidia in de winter (bradytictic) of voor een korte periode in de zomer (tachytictic)18. De overwintering van Mossel broods werd gesteund toen de voortplantingscyclus van Anodonta werd bestudeerd19. De basis reproductie biologie werd echter door de jaren heen grondig bestudeerd en vond deze dichotomie een grove generalisatie en broed perioden van sommige soorten zijn veel complexer dan oorspronkelijk verondersteld20,21. Bijvoorbeeld, soorten van het geslacht hyridella (familie hyriidae), glebula, en elliptio (familie Unionidae) zijn waargenomen met opwaarts van drie broods per broedseizoen22,23, 24. De complexiteit van soortspecifieke, en soms zelfs populatie-specifieke20, voortplantings gewoonten heeft geleid tot een leemte in de kennis over de timing en de duur van broeden, en het aantal broods dat een vrouwelijke Mossel kan produceren.
Hoewel hypodermische spuiten zijn gebruikt om Gill-inhoud te extraheren, is de rapportage van de resultaten ingewikkeld vanwege het gebrek aan standaardisatie om vergelijkbare resultaten in alle onderzoeken te garanderen. Eerder werden vier ontwikkelingsstadia van glochidia (d.w.z. ei, embryo, onvolwassen, volledig ontwikkeld) geïdentificeerd in Unionidae, maar zijn niet in de standaardprocedure16,25,26vastgesteld. Andere studies die de leden van margaritiferidae observeren, hebben de classificatie van ‘ onvolgroeide glochidia ‘ vervangen door ‘ het ontwikkelen van glochidia ‘, wat leidt tot een mogelijke verwarring van27,28. Het gebrek aan consistentie bij het karakteriseren van de verschillende larvale ontwikkelingsstadia heeft veel onderzoekers verlaten om in het algemeen broze vrouwtjes te beschrijven als ‘ gravid ‘, wat niet de fijne kneepjes van de larvale ontwikkeling omvat. Life History studies met host-Fish Trials hebben de behoefte aan zwangere-vrouwtjes met een volledig ontwikkelde glochidia geprioriteerde, maar deze informatie is verspreid over gepubliceerde en ongepubliceerde literatuur29,30. Momenteel ontbreken gegevens over het voortplantingsgedrag van veel Mossel soorten, waaronder de timing van de overgang tussen ei, onrijpe glochidia en volledig ontwikkelde glochidia klaar voor bevestiging aan gastheren. Voor de meeste soorten is het onduidelijk hoe lang vrouwtjes brood glochidia en hoe snel bevruchte eitjes zich volledig ontwikkelen. De kennislacunes zijn vaak breder voor soorten instandhoudings zorg, die de noodzaak van een gestandaardiseerde methode voor het extraheren van Gill-inhoud die is getest op niet-dodelijke effecten en kan worden bevorderd tot de wetenschappelijke gemeenschap ter aanvulling van reguliere gegevensverzamelingsmethoden, zonder een bedreiging voor de beschermde populaties te vormen24,31,32.
Deze studie had drie doelstellingen: 1) formaliseren van een Gill sampling techniek en testen voor dodelijke en niet-dodelijke effecten op vrouwelijke mosselen in situ, 2) karakteriseren verschillende stadia van glochidial ontwikkeling en beschrijven een gestandaardiseerde methode voor het identificeren en het rapporteren van verschillende larvale stadia, en 3) Maak een openbare repository voor de verzamelde gegevens. Veld enquêtes, lange termijn monitoring projecten, en museumcollecties vertegenwoordigen alle mogelijkheden voor het hier beschreven protocol en aanvullende gegevens die moeten worden verzameld voor een bredere interesse. Het geformaliseerde protocol bevat visuals en karakterbeschrijvingen voor het differentiëren van elke fase van de larvale ontwikkeling. Door de categorieën te standaardiseren, kunnen de verzamelde resultaten worden vergeleken bij alle voorvallen en soorten. Zodra gegevens worden verzameld, kunnen alle worden ingediend bij de zoet water Mossel Gravidity almanac (FMGA), een database voor gravidity informatie verzameld met behulp van dit protocol. Een eindproduct voor het opslaan en compileren van alle gravidity verzamelde informatie zal een onderzoeksinstrument bieden om toekomstig onderzoek, behoud en herstel inspanningen te faciliteren. De opname van deze methodologie in verschillende Mossel projecten en de indiening van gegevens aan FMGA zou het hele jaar door de brede kennis over de gravidity status van Mossel soorten uitbreiden. Dit protocol en de resulterende database over het voortplantingsgedrag van zoetwatermosselen is als een zeer belaagde groep van organismen essentieel om de populatiedynamiek te begrijpen en het behoud van deze soorten te vergemakkelijken.
Betekenis
Instandhouding van onbeschermde soorten is afhankelijk van succesvolle rekrutering binnen bestaande populaties. In sommige gevallen kan kunstmatige vermeerdering nodig zijn om de werving van deze risicopopulaties te vergroten. Dit vereist dat onderzoekers worden geïnformeerd over de timing van de actieve reproductie voor elke soort en mogelijk verschillende methodologieën of beheerspraktijken toepassen om de impact op de werving te beperken. Als een ontoiled groep van organismen is het van het grootste belang om een gestandaardiseerde en niet-dodelijke benadering te hanteren voor het bestuderen van voortplantings gewoonten, en om een platform te bieden waarop gegevens kunnen worden gecompileerd en visualiseren om de wetenschappelijke gemeenschap te informeren over de meest up-to-date beschikbare informatie. Deze studie biedt een stapsgewijs protocol om ervoor te zorgen dat er voorzorgsmaatregelen worden genomen en Gill-inhoud kan adequaat worden bemonsterd en geëvalueerd door vrouwelijke mosselen. Dit protocol is getest op dodelijke en niet-dodelijke effecten, waardoor onderzoekers en managers deze methodologie op een verantwoorde manier kunnen implementeren. We ontwikkelden ook een reeks database management tools en applicaties om de compilatie van gravidity informatie op een publiek beschikbaar, gebruiksvriendelijk dashboard te faciliteren. Studies over epidemiologie, glochidia morfologie, levensgeschiedenis, fylogenetica, propagatie, en translocaties kunnen allemaal profiteren en gebruik maken van deze repository van temporele gravidity informatie voor alle soorten van zoetwatermosselen.
Deze studie alleen ondersteunde eerdere studies ‘ bevindingen van sommige soorten voortplantings gewoonten, maar ook onthuld nieuwe informatie over anderen. Hoewel v. vibex in minder aantallen dan v. lienosawerd verzameld, zijn er gelijkenissen gevonden tussen de twee op basis van de gravidity gegevens. Beide soorten villosa lijken tijdens een groot deel van het jaar volledig ontwikkelde glochidia te broeden, wat ze karakteriseert als een overwinterende brooder. Dit is consistent met eerdere studies over andere villosa soorten43,44,45. De resultaten van deze studie suggereren dat H. australis kan worden gevonden zwangere van oktober en overwinterende in juni, behalve dat geen opnames werden gevonden zwangere in december. Een eerder gepubliceerde studie geïdentificeerd congeneer H. altilis met een gravidity periode van vier maanden, maart tot en met juni46,47. Deze bevinding illustreert een langere gravidity periode dan eerder gedacht en in het algemeen groepen H. australis als een overwinterende brooder. Als federaal beschermde soorten kunnen wisselende broed perioden voor h. altilis en h. australis invloed hebben op beheersbeslissingen om populaties beter te beschermen tijdens reproductief actieve tijden. Elliptio pullata werden alleen gevonden zwangere met ei in mei en juni die overeenkomt met hun karakterisering als een tachytictic soort met een zeer korte broedperiode24,48,49, 50. Naarmate gegevens worden gecompileerd op Elliptio -soorten met behulp van dit protocol, kan gedetailleerde informatie de veld inspanningen efficiënter maken wanneer bepaalde glochidial-ontwikkelingsstadia zijn gericht, omdat glochidia slechts enkele maanden uit het jaar wordt gevonden. Deductie van de andere soorten met lagere steekproefgroottes is beperkt, maar naarmate gegevens in de database worden gecompileerd, geven hogere steekproefgrootten inzicht in de voortplantings gewoonten van extra Mossel soorten.
Procedurele opmerkingen
Zoetwatermosselen en hun glochidia zijn bekend om gevoelig te zijn voor antropogene stressoren10,35. Tijdens de gravidity inspectie zijn de Mossel kleppen mogelijk niet gemakkelijk te openen, en het onzorgvuldig forceren van de kleppen open kan onbedoelde schade veroorzaken en resulteren in stress of sterfte. Sommige fragiele gepeld soorten (bijv. soorten Anodonta, leptodea, utterbackia, enz.) en kleinere individuen kunnen zeer fragiele schelpen en zwakke adder spieren hebben die gemakkelijk kunnen breken en scheuren. Gill sampling kan worden beschouwd als een stressor als de behandeling niet verantwoord en met de nodige voorzichtigheid wordt gedaan. Uit een eerdere studie bleek dat het hanteren en blootstelling van de lucht bij mosselen tijdens de reproductief actieve tijden verschillende fysiologische stress kan veroorzaken, waaronder de vroegtijdige afgifte van Gill-inhoud34. Echter, een studie met behulp van een soortgelijke methodologie zoals hier beschreven, gevonden omgaan met zwangere vrouwelijke mosselen tijdens Gill bemonstering niet onderbreken de huidige broed of veroorzaken vroegtijdige vrijlating in zowel korte-en lange-termijn broeden soorten16. Bovendien moet tijdens dit protocol een steriele spuit worden gebruikt om onbedoelde infectie of kruisbesmetting te voorkomen bij het prikken van kieuwen van meerdere personen. Bovendien, glochidia zijn kwetsbaar en broods kunnen worden gerijpt en gestrest, maar niet uitgezet. Volwassen glochidia in slechte gezondheid kan resulteren in minder individuen reageren op zout tests35. Bij het maken van het onderscheid tussen DG (T) en FDG (T) is het belangrijk om zout te testen met een grote steekproefomvang, aantekeningen te maken op observaties om onderscheid tussen DG en FDG glochidia zorgvuldig te identificeren aan de hand van de beschrijvingen die in deze studie worden gegeven. Wanneer de juiste verzorging wordt gemaakt, kan de minimale stress die door deze procedure wordt veroorzaakt, vrouwelijke mosselen in staat stellen om glochidia natuurlijk voort te zetten en de impact op rekrutering in de populatie te verminderen.
Aanvullende gegevens kunnen worden opgenomen ter aanvulling van de database en bieden een brede context voor reproductieve gewoonten van zoetwatermosselen. Sommige soorten (bijv. soorten Fusconaia), zijn waargenomen om kieuwen van verschillende kleuren te hebben op basis van de ontwikkelingsfase van de glochidia51. Tijdens een initiële gravidity controle van het vrouwtje, kan een beschrijving van de Gill Color worden opgenomen in de gerapporteerde gegevens om toekomstig onderzoek mogelijk te maken. Ook, op dit punt in het Protocol, onderzoekers kunnen opmerken of de broeden vrouw werd gevonden broeden glochidia in de twee buitenste kieuwen (ectobranchus), twee innerlijke kieuwen (endobranchus), of alle vier kieuwen (tetragene)17. Deze informatie kan worden toegevoegd aan FMGA en helpen bij het invullen van gegevens hiaten met betrekking tot broeden voor elke onderzochte diersoort. Milieuomstandigheden, met name watertemperatuur, kunnen worden verzameld en geregistreerd in het veld voor een uitgebreidere observatie van de gravidity status en timing van soorten in verschillende latitudinale bereiken. Uit onderzoek blijkt dat milieuparameters, zoals temperatuur, foto operiod, debiet en beschikbaarheid van levensmiddelen, voortplantings verschijnselen kunnen veroorzaken in zoetwatermosselen52,53,54,55 ,56. Aanvullende velden kunnen worden toegevoegd aan de database als ze worden ingediend ter bevordering van toekomstig onderzoek naar abiotische factoren die van invloed zijn op de grafediteit. Een wijziging van Capture-Mark-recapture gemodelleerd na onze studie kan ook aan dit protocol worden toegevoegd, waardoor onderzoekers de voortplantings gewoonten van een specifiek Mossel kunnen monitoren en informatie over meerdere broods per jaar konden onthullen.
De juistheid van de informatie in de FMGA is afhankelijk van de bron. De identificatie van zoetwatermosselen is bijvoorbeeld gebruikelijk als gevolg van het feit dat veel soorten soortgelijke externe kenmerken hebben die het moeilijk maken om onderscheid tussen soorten57. Een Gill-monster van een verkeerd geïdentificeerd individu zou verwarring en valse informatie kunnen creëren voor de broedperiode van een soort. Als er een Gill-monster wordt genomen, moeten er Foto’s worden genomen van beide kleppen (als het individu niet in leven is), buiten de rechterklep en de umbo (scharnier waar twee kleppen zijn verbonden) en verzonden met gravidity gegevens via de desktopsite of mobiele applicatie. We verwelkomen ook foto’s van de Gill-inhoud. Binnen de indieningsformulieren is er een drop-down menu waarmee de verzamelaar hun betrouwbaarheidsniveau met betrekking tot soorten identificatie aangeeft. Voordat de registratie wordt gevalideerd, wordt deze informatie in aanmerking genomen bij het controleren van de identificatie van de verzamelaar tegen plausibele distributie, enz. Vanwege de hoge mate van intraspecifieke morfologische variatie in soorten Unionidae wordt het indienen van weefselmonsters aangemoedigd en kan het nodig zijn om moleculaire identificatie mogelijk te maken.
Toekomstige implicaties
Als niet-dodelijke methode kan dit protocol worden toegepast op zowel gewone als ondoorlatende soorten. De gravidity kalenders voor onverijdelde soorten kunnen instandhoudings managers helpen die betrokken zijn bij bedreigde soorten wetgeving en herstelplanning door informatie te verstrekken over perioden waarin soorten reproductief actief zijn. De staats-en federale agentschappen die risicosoorten beheren, kunnen beter adviseren om toewijzingen toe te staan voor tijden waarin de soort niet kwetsbaar is en weer wordt geproduceerd, en zelfs de oogst van de vis van de gastheer beperken in tijden dat mosselen een volledig ontwikkelde glochidia zijn. Daarnaast kunnen veld enquêtes doelsoorten targeten tijdens niet-reproductieve perioden om de impact op wervingsprocessen te minimaliseren. De openbaar toegankelijke database, FMGA, biedt onderzoekers en managers een hulpmiddel om belangrijke reproductieve informatie te verkrijgen over alle doel dierwater Mossel soorten. De database zal ook gegevens hiaten markeren, het aanmoedigen van verder onderzoek naar soortspecifieke broeden patronen. Aangezien het begrijpen van een soort voortplantings patroon het mogelijk maakt om adequate beheersbeslissingen te nemen, hopen we dat ons protocol en onze database toekomstig onderzoek, behoud en herstel van zoet water Mossel mogelijk maken.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen de financieringsbronnen bedanken: U.S. Fish and Wildlife Service en U.S. Geological Survey. Een speciale dank aan Andrew Hartzog en Sandra Pursifull voor het organiseren van veld bemanningen en gegevensverzameling, samen met Lauren Patterson en Chris Anderson voor hun waardevolle bijdragen aan database ontwikkeling. We willen ook iedereen bedanken die heeft geholpen op het gebied en het laboratorium, waaronder Sherry Bostick, Mark Cantrell, Sahale Casebolt, Jordan Holcomb, Howard Jelks, Gary Mahon, John McLeod, Kyle Moon, Cayla Morningstar, Emma pistole, Matt Rowe, Channing St. Aubin en Jim Williams. Elk gebruik van handels-, firma-of productnamen is alleen voor beschrijvende doeleinden en impliceert geen goedkeuring door de Amerikaanse overheid.
1.5 mL snap cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost. |
20 G needle on 10 mL disposable syringe | Exelint International | 26255 | sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2" |
Dissecting Microscope | any | any | |
Marking Pen | Fisher Scientific | 13-379-4 | This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof. |
Molecular grade ethanol | any | any | Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work. |
Paper | any | any | Needed to record information on samples collected. |
Pen/pencil | any | any | If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine. |
Petri dish | DWK Life Sciences (Kimble) | 23000-9050 | This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used. |
Sodium Chloride | any | any | Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this. |
Speculum | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |
Sterile water | any | any | Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection. |
Super glue | Gorilla | Gorilla super glue gel | Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
Tags | Hallprint | FPN 8×4 | Only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
Transfer Pipet | Thermo Scientific Samco | 225 | This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable. |
Tweezers | any | any | Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this. |
Waterproof paper | RainWriter | any | Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from. |
Wooden pick | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |