Split Korneal Düğmeleri Kullanarak Bir Domuz Korneal Endotel Organ Kültür Modeli
Summary
Burada domuz eti bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi için adım adım bir protokol sunulmuştur. Bu organo-tipik ekili organ kültürü modeli 15 gün içinde hücre ölüm oranlarını gösterir gibi, insan donör kornea karşılaştırılabilir, toksik dekstran eklemeden insan dışı kornea uzun vadeli ekimi sağlayan ilk modeli temsil eder.
Abstract
Kornea endotel hücreleri üzerinde deneysel araştırma çeşitli zorluklarla ilişkilidir. İnsan donör kornealar nadirdir ve normalde transplantasyon için gerekli olduğu için deneysel araştırmalar için nadiren kullanılabilir. Endotel hücre kültürleri genellikle in vivo durumlara iyi tercüme etmez. İnsan olmayan korneaların biyoyapısal özellikleri nedeniyle, ekim sırasında stromal şişlik önemli kornea endotel hücre kaybına neden olur, bu da uzun bir süre için ekimi yapmak zor hale getirir. Bu yanıtı etkisiz hale getirmek için dextran gibi şişme ajanları kullanılır. Ancak, onlar da önemli endotel hücre kaybına neden olur. Bu nedenle şişme ajanlar gerektirmeyen bir ex vivo organ kültür modeli oluşturulmuştur. Yerel bir mezbahadan domuz gözleri bölünmüş kornea düğmeleri hazırlamak için kullanılmıştır. Kısmi kornea trehinasyonundan sonra korneanın dış katmanları (epitel, bowman tabakası, stromanın bazı kısımları) çıkarıldı. Bu önemli ölçüde büyük stromal şişme ve Descemet membran uzun ekim dönemleri boyunca katlama tarafından indüklenen kornea endotel hücre kaybını azaltır ve endotel hücre tabakasının genel korunmasını artırır. Sonraki tam kornea trehinasyonu kalan göz soğanı ve ekimi bölünmüş kornea düğmesinin kaldırılması izledi. Endotel hücre yoğunluğu, ışık mikroskobu kullanılarak hazırlıktan 15 gün sonraya kadar (örn. 1, 8, 15 gün) takip sürelerinde değerlendirildi. Kullanılan hazırlama tekniği daha az stromal doku şişmesi ile etkin endotel hücre tabakasının daha iyi korunmasını sağlar, hangi insan donör kornea karşılaştırılabilir bölünmüş kornea düğmelerinde yavaş ve doğrusal düşüş oranları ile sonuçlanır. İlk kez bu standart organo-tipik ekili araştırma modeli en az iki hafta istikrarlı bir ekimi sağlar gibi, onların açısından çeşitli dış faktörlerin gelecekteki araştırmalar için insan donör kornealar için değerli bir alternatiftir kornea endotel üzerindeki etkileri.
Introduction
Kornea transplantasyon işlemleri dünya çapında en sık yapılan transplantasyonlar arasında dır1. İnsan donör kornea ciddi bir sıkıntısı olduğu gibi, insan kornea kornea kornea endotel hücrelerini ele deneysel araştırma1gerçekleştirmek zordur. Ancak, göz içinde kullanılan sulama solüsyonları ve diğer maddelerin, oftalmik viskoelastik cihazların yanı sıra cerrahi alet ve tekniklerin (örn. fakoemülsifikasyon aletleri ve teknikleri, ultrason enerjisi) tanıtılması, klinik kullanım dan önce kornea endotel üzerindeki etkileri ile ilgili geçerli ve kapsamlı araştırmalar.
Araştırma için insan donör kornealarına birkaç alternatif vardır. Hayvan araştırma modelleri çok değerli ama aynı zamanda çok kaynak tüketen ve giderek etik sorgulanan. In vitro hücre kültürlerinin önemli bir dezavantajı insan gözüne sınırlı çeviri olduğunu. Hücre kültürlerinden elde edilen sonuçlar in vivo koşullara uyumsuz olabilir, çünkü hücreler endotel mezenkimal geçiş (EMT) geçirebilir, bu da hücre polaritesinin kaybı ve hücre şekli ve gen değişikliklerinden kaynaklanan fibroblast benzeri morfolojiile sonuçlanabilir. ifade2.
Önceki ex vivo modelleri sadece 120 saate kadar ekim süreleri rapor ederken, en az 15 gün taze domuz korneaları kültüre getirerek bir domuz kornea endotel organ kültür modeli oluşturmak için yeni bir hazırlık tekniği son zamanlardatanıtıldı 3 3 ,4,5,6. Kornea epiteli ve stromanın parçaları ekimden önce korneadan çıkarılırsa (toplam 300 m) stromanın şişmesi bölünmüş kornea düğmelerinde azalır ve bu da daha az endotel hücre kaybına ve bakımlı endotel kaybına neden olur. hücre tabakası 15 güne kadar, bölünmemiş kornea düğmeleri ise düzensiz stromal şişlik ve Descemet kıvrımlarının oluşumuna bağlı olarak önemli endotel hücre kaybı gösterir. Göz bankaları genellikle transplantasyon öncesi kornea ların şişmesini azaltmak için dekstran gibi ozmotik deswelling ajanları kullanır. Ancak, bu ajanlar artmış endotel hücre kaybınedengösterilmiştir 7,8,9.
Bu makalede, gelecekteki araştırmacıların bölünmüş kornea düğmeleri kullanarak kornea endotel üzerinde araştırma yapmalarını sağlamak amacıyla bu standartlaştırılmış ex vivo araştırma modelini ayrıntılı bir adım adım protokolde görselleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu model, göz içi viskoelastik cihazlar, sulama solüsyonları ve ultrason enerjisi veya kornea endotellerinin ilgi çekici olduğu diğer işlemler gibi göz içinde kullanılan maddeleri ve teknikleri test etmek için basit bir yöntemi temsil eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol araştırma amaçlı standart ve düşük maliyetli ex vivo kornea endotel organ kültür modeli temsil domuz bölünmüş kornea düğmeleri, hazırlanması için bir yöntem sağlar6. Domuz bölünmüş kornea düğmeleri iki haftalık bir süre içinde göz bankalarında ekili insan donör korneagöz görülen endotel hücre kayıpları ile karşılaştırılabilir endotel hücre yoğunluğunda bir azalma gösterdi6,10,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sunulan araştırma modelinin kurulması, Almanya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı’nın KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien – Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture – The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle – mind the ethical gap!. ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
