Un modèle de culture d'orgue endothéliale de porc cornée utilisant des boutons cornéens fendus

Summary

Ici, un protocole étape par étape pour la préparation et la culture des boutons cornéens fendus porcins est présenté. Comme ce modèle de culture d’organes organo-typiquement cultivé montre des taux de mortalité cellulaire dans les 15 jours, comparables aux cornées de donneurs humains, il représente le premier modèle permettant la culture à long terme de cornées non humaines sans ajouter de dextran toxique.

Abstract

La recherche expérimentale sur les cellules endothéliales cornéennes est associée à plusieurs difficultés. Les cornées de donneur humain sont rares et rarement disponibles pour des investigations expérimentales car elles sont normalement nécessaires pour la transplantation. Les cultures cellulaires endothéliales ne se traduisent souvent pas bien dans des situations in vivo. En raison des caractéristiques biostructurales des cornées non humaines, le gonflement stromal pendant la culture induit la perte substantielle de cellules endothéliales cornéennes, qui le rend difficile d’exécuter la culture pendant une période prolongée de temps. Des agents de dégonflement tels que le dextran sont utilisés pour contrecarrer cette réponse. Cependant, ils causent également la perte significative de cellules endothéliales. Par conséquent, un modèle ex vivo de culture d’organe n’exigeant pas des agents degonflement a été établi. Les yeux de porc d’un abattoir local ont été utilisés pour préparer des boutons cornésaux fendus. Après la tréphination cornéenne partielle, les couches extérieures de la cornée (épithélium, couche d’archer, parties du stroma) ont été enlevées. Ceci réduit de manière significative la perte endothéliale cornéenne induite par le gonflement stromal massif et le pliage de membrane de Descemet pendant de plus longues périodes de culture et améliore la conservation générale de la couche cellulaire endothéliale. La tréphination cornée complète suivante a été suivie par l’enlèvement du bouton cornéen fendu de l’ampoule et de la culture restantes d’oeil. La densité cellulaire endothéliale a été évaluée à des heures de suivi allant jusqu’à 15 jours après la préparation (c.-à-d., jours 1, 8, 15) utilisant la microscopie légère. La technique de préparation utilisée permet une meilleure préservation de la couche cellulaire endothéliale permise par moins de gonflement des tissus stromaux, ce qui entraîne des taux de déclin lents et linéaires dans les boutons cornésaux fendus comparables aux cornées des donneurs humains. Comme ce modèle de recherche organo-typiquement cultivé standardisé permet pour la première fois une culture stable pendant au moins deux semaines, il s’agit d’une alternative valable aux cornées des donneurs humains pour les études futures de divers facteurs externes en ce qui concerne leur effets sur l’endothélium cornéen.

Introduction

Les procédures de transplantation cornéenne sont parmi les transplantations les plus couramment effectuées dans le monde¹. Comme il y a une grave pénurie de cornées de donneurs humains, il est difficile d’effectuer¹. Cependant, l’introduction de solutions d’irrigation et d’autres substances utilisées dans l’œil, les dispositifs viscoélastiques ophtalmiques, ainsi que les instruments et techniques chirurgicaux (p. ex., instruments et techniques de phacoemulsification, énergie par ultrasons) nécessite des investigations valides et étendues concernant leurs effets sur l’endothélium cornéen avant utilisation clinique.

Il existe peu d’alternatives aux cornées de donneurs humains pour la recherche. Les modèles de recherche sur les animaux sont très précieux, mais en même temps très gourmands en ressources et de plus en plus remis en question sur le plan éthique. Un inconvénient majeur des cultures cellulaires in vitro est leur traduction limitée à l’œil humain. Les résultats obtenus à partir de cultures cellulaires peuvent être incongrus à des conditions in vivo, parce que les cellules peuvent subir une transition mésenchymale endothéliale (EMT), résultant en morphologie fibroblaste-like causée par la perte de polarité cellulaire et les changements dans la forme cellulaire et le gène expression².

Alors que les modèles ex vivo précédents ont rapporté des périodes de culture allant jusqu’à seulement 120 h, une nouvelle technique de préparation pour établir un modèle de culture endothéliale endothéliale de porc porc porcin en creusant les cornées fraîches pendant au moins 15 jours a été récemment introduite^{3 ,4,5,6}. Si l’épithélium cornéen et certaines parties du stroma sont retirés (environ 300 m au total) de la cornée avant la culture, l’enflure du stroma est réduite en boutons cornésaux fendus, ce qui entraîne une diminution de la perte de cellules endothéliales et une endothéliale bien entretenue. couche cellulaire après jusqu’à 15 jours, tandis que les boutons cornéens non divisés montrent une perte importante de cellules endothéliales due à un gonflement stromal inégal et la formation des plis de Descemet. Les banques oculaires utilisent habituellement des agents de dégonflement osmotiques tels que le dextran pour réduire l’enflure des cornées avant la transplantation. Cependant, ces agents ont été montrés pour induire la perte endothéliale accrue de cellules^7,8,9.

Cet article vise à visualiser ce modèle de recherche ex vivo standardisé dans un protocole détaillé étape par étape afin de permettre aux futurs chercheurs d’effectuer des recherches sur l’endothélium cornéen à l’aide de boutons cornésiens fendus. Ce modèle représente une méthode simple pour tester les substances et les techniques utilisées dans l’œil, telles que les dispositifs viscoélastiques ophtalmiques, les solutions d’irrigation et l’énergie par ultrasons, ou d’autres procédures où l’endothélium cornéen est d’intérêt.

Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices éthiques de notre institution. Conformément aux statuts du comité d’examen éthique de notre institution, aucune approbation éthique n’a dû être obtenue avant les expériences, car toutes les cornées porcines ont été obtenues de l’abattoir local. 1. Culture d’orgue Préparer les yeux de porc. De l’abattoir local, obtenir des yeux de porc qui ont été enlevés peu de temps après l’autopsie, mais avant le traitement thermique….

Representative Results

La technique de dissection présentée implique l’ablation partielle du tissu stromal, ce qui entraîne un échantillon de cornée plus mince et donc moins de gonflement stromal(figure 1 et figure 2). Moins de gonflement stromal induit moins de cisaillement et de pincement forces qui ont un impact négatif sur l’endothélium cornéen, causant ainsi des taux inférieurs de perte cellulaire endothéliale6. L…

Discussion

Ce protocole fournit une méthode pour la préparation des boutons cornésales fendus porcins, qui représente un modèle standardisé et à faible coût ex vivo de culture d’organe cornélial à des fins de recherche⁶. Les boutons cornéséaux fendus de Porc porcont ont montré une diminution de la densité endothéliale de cellules comparable aux pertes endothéliales de cellules observées dans les cornées de donneur humain cultivées dans les banques d’oeil sur une période de deux semaines<s…

Materials

Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland