Summary

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Published: September 20, 2019
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Summary

In diesem Protokoll werden Lymphozyten in die obere Kammer eines Transmigrationssystems gelegt, die durch eine poröse Membran von der unteren Kammer getrennt sind. Chemokin wird der unteren Kammer hinzugefügt, was eine aktive Migration entlang eines Chemokingradienten induziert. Nach 48 h werden Lymphozyten in beiden Kammern gezählt, um die Transmigration zu quantitieren.

Abstract

Hierbei präsentieren wir eine effiziente Methode, die mit grundlegenden Laborfertigkeiten und Materialien ausgeführt werden kann, um die lymphozyte chemokine Bewegung in einem Ex-vivo-Transmigrationssystem zu bewerten. Angeborene Lymphzellen der Gruppe 2 (ILC2) und CD4+ T-Helferzellen wurden aus Milz und Lunge von Hühnerei-Ovalbumin (OVA)-herausgeforderten BALB/c-Mäusen isoliert. Wir haben die Expression von CCR4 auf CD4+ T-Zellen und ILC2, vergleichsweise bestätigt. CCL17 und CCL22 sind die bekannten Liganden für CCR4; Daher haben wir mit dieser Ex-vivo-Transmigration-Methode die CCL17- und CCL22-induzierte Bewegung von CCR4+ Lymphozyten untersucht. Um Chemokin-Gradienten zu ermitteln, wurden CCL17 und CCL22 in die untere Kammer des Transmigration-Systems gelegt. Isolierte Lymphozyten wurden dann den oberen Kammern zugesetzt und über einen Zeitraum von 48 h wanderten die Lymphozyten aktiv durch 3 m Poren in Richtung Chemokin in der unteren Kammer. Dies ist ein wirksames System zur Bestimmung der Chemokinetik von Lymphozyten, imitiert aber verständlicherweise nicht die Komplexitäten, die in den in vivo Organmikroumgebungen zu finden sind. Dies ist eine Einschränkung der Methode, die durch die Zugabe von In-situ-Bildgebung des untersuchten Organs und Lymphozyten überwunden werden kann. Im Gegensatz dazu besteht der Vorteil dieser Methode darin, dass ein Einsteigertechniker viel kostengünstiger als Live-Bildgebung durchgeführt werden kann. Da therapeutische Verbindungen zur Verbesserung der Migration verfügbar werden, wie im Falle von Tumor infiltrierenden zytotoxischen Immunzellen, oder um die Migration zu hemmen, vielleicht im Falle von Autoimmunerkrankungen, bei denen die Immunpathologie von Beunruhigung ist, kann diese Methode als Screening-Tool. Im Allgemeinen ist die Methode wirksam, wenn das Chemokin von Interesse konsequent Chemokinetik auf einem statistisch höheren Niveau als die Medienkontrolle erzeugt. In solchen Fällen kann auch der Grad der Hemmung/Verbesserung durch eine bestimmte Verbindung bestimmt werden.

Introduction

Diese ursprüngliche Transmigration-Methode wurde 1962 von Stephen Boyden im Journal of Experimental Medicine1vorgestellt. Vieles von dem, was wir über Chemotaxis und Chemokinetik wissen, wäre ohne die Entwicklung der Boydenkammer nicht möglich. Vor der Entdeckung des ersten Chemokins im Jahr 1977 wurden Ex-vivo-Transmigrationssysteme verwendet, um mehr über Serumfaktoren zu erfahren, die zelluläre Bewegungen in Makrophagen festsetzen könnten, während die zelluläre Motilität in Neutrophilen verstärkt wird1,2. Es wurde ein riesiger Wissensschatz in Bezug auf die Immunzellmigration entwickelt, und bis heute wurden 47 Chemokine mit 19 entsprechenden Rezeptoren3,4entdeckt. Darüber hinaus haben viele Inhibitoren/Enhancer dieser Chemokin-Wege eine Entwicklung zu therapeutischenZwecken5,6,7,8. Viele dieser Verbindungen wurden in ähnlichen Transmigrationskammern getestet, um direkte Wechselwirkungen zwischen den Verbindungen und immunzellige Reaktionsfähigkeit auf ein bestimmtes Chemokin zu verstehen9.

Transmigration, oder Diapedese, in entzündetes Gewebe ist ein wesentlicher Prozess für eine gesunde Entzündungsreaktion auf klare Infektion10,11. Ein Boyden-Kammer-, Transmigrationssystem oder Transwell-Apparat besteht in der Regel aus zwei Kammern, die durch eine poröse Membran1,12getrennt sind. Die untere Kammer hält am häufigsten Medien, die das Chemokin von Interesse enthalten, während Leukozyten in der oberen Kammer platziert werden. Die Größe der Pore in der Membran kann basierend auf der Größe der betreffenden Zelle ausgewählt werden. Für dieses Projekt haben wir eine poröse Membran von 3 m ausgewählt, da die Lymphzellen je nach Stadium der zellulären Entwicklung 7-20 m groß sind. Diese Porengröße stellt sicher, dass diese Zellen nicht passiv durch die Poren fallen, sondern dass sie aktiv als Reaktion auf den Chemokingradienten migrieren.

Der hauptvorteil dieses Protokolls ist seine Wirtschaftlichkeit. Die In-vivo-Transmigration ist schwierig, da sie eine umfassende Ausbildung im Umgang mit Tieren und in der Chirurgie erfordert und häufig eine hochleistungsfähige Mikroskopie erfordert, die einem Forscher nicht immer zur Verfügung steht. Kostengünstiges Screening von Verbindungen, von denen angenommen wird, dass sie die Transmigration verbessern oder hemmen, kann vor der In-vivo-Bildgebung durchgeführt werden. Da das Transmigrationssystem streng kontrolliert wird, können Zellen zunächst dem Transwell-Apparat zugesetzt werden, oder umgekehrt kann das Chemokin zuerst mit einem Chemokin-Inhibitor behandelt werden, dann mit Zellen, die dem Transwell-Apparat zugesetzt werden. Schließlich können Endothelzellen und/oder Kellermembranproteine 1-2 Tage vor dem Transmigrationsexperiment an der Unterseite des Transwell-Inserts zugesetzt werden, um die Beteiligung dieser Barrierezellen an der Chemokinetik zu verstehen. Auch diese Manipulationen des Systems bieten ein leistungsfähiges Mittel, um wichtige Informationen über die Wirksamkeit einer bestimmten Verbindung im Vorfeld komplizierterer In-vivo-Studien zu bestimmen.

Die Verwendung eines Transmigrationskammersystems ist eine effektive Möglichkeit, die Lymphozytenmobilität unter verschiedenen In-vivo- und In-vitro-Bedingungen12,13,14zu bewerten. Hierin beschreiben wir eine optimierte Methode zur Beurteilung der Ex-vivo-Lymphozytenreaktion auf Chemokine in einer Transmigrationskammer. In diesem Beispielexperiment wurden CD4+ T-Zellen und angeborene Lymphzellen der Gruppe 2 (ILC2) nach der OVA-Allergen-Exposition von männlichen und weiblichen BALB/c-Mäusen isoliert. Es wurde die Hypothese erstellt, dass CCR4+ CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2 von allergenbekämpften Mäusen effizienter in Richtung CCL17 und CCL22 migrieren würde als CCR4+ CD4+ T-Helferzellen. CCL17 und CCL22 sind Chemokine, die häufig von dendritischen Zellen und Makrophagen des M2 (allergischen) Phänotyps unter anderen Zellen, in Allergie15,16produziert werden. CCL17 und CCL22 können als Biomarker allergischer Entzündungen betrachtet werden, da sie bei Atemwegsexazerbationen16,17,18leicht in der Lunge nachgewiesen werden können. Wichtig ist, dass die CCR4-Expression im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen erhöht ist, wie aus bioinformatischen Daten hervorgeht, die aus ILC2 gewonnen wurden, das von Hausstaubmilben behandelten Tieren isoliert wurde, und ähnlich ILC2 von naiven Tieren, die ex vivo mit IL-33 behandelt wurden ( allergenförderndes angeborenes Zytokin) upreguliert CCR419,20. Darüber hinaus ist CCR4 mRNA nach Daten für ILC2 in der Datenbank des Immunologischen Genomprojekts (www.immgen.org) in diesen angeborenen Immunzellen stark exprimiert. Bis heute ist wenig über den Handel mit ILC2 in Gewebe bekannt, aber es ist wahrscheinlich, dass die ILC2- und CD4+ T-Zellen ähnliche Chemokine und Rezeptoren für Chemotaxis und Chemokinetik verwenden, da sie ähnliche Transkriptionsfaktoren und Rezeptoren ausdrücken. So verglichen wir CCL17 versus CCL22 Reaktionsfähigkeit, von ILC2 und CD4+ T Lymphozyten, von männlichen und weiblichen, OVA-herausgeforderten Tieren.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees am University of Nebraska Medical Center (UNMC) und der University of Utah überprüft und genehmigt. 1. Aufbau und Herstellung von Reagenzien Bereiten Sie komplette RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medien vor. Fügen Sie 10 ml hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) zu 90 ml RPMI hinzu. 1 ml 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamin zu 100 ml von…

Representative Results

CCR4-Expression auf CD4+ T-Zellen und ILC2. Für den Erfolg des Ex-vivo-Transmigrationsexperiments ist es unerlässlich, zu bestimmen, ob die Lymphozyten auf CCL17 und CCL22 über CCR4 reagieren; Daher haben wir die CCR4-Expression sowohl auf CD4+ T-Zellen als auch auf ILC2 durch Durchflusszytometrie bestimmt. Obwohl bekannt ist, dass OVA-spezifische CD4+ Helfer-T-Zellen CCR4 exprimieren, ist weniger über die Expression von CCR4 auf ILC2 bekannt. <strong…

Discussion

Hierbei stellen wir eine etablierte Methode zur Beurteilung der chemokininduzierten Migration von Lymphozyten in einem Ex-vivo-Transmigrationssystem vor. Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll, von denen der erste die Überprüfung der Expression des richtigen Chemokinrezeptors auf die Immunzellen im Experiment ist. In unseren Händen haben wir uns für CCR4 entschieden, weil die Literatur die Bedeutung von CCR4 auf Th2-Helfer-T-Zellen bei allergischen Entzündungen hervorhebt. Ovalbumin-induzierte Entzündung w…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der American Lung Association (K.J.W.), dem Memorial Eugene Kenney Fund an T.A.W. und K.J.W., großzügiger Start-up-Unterstützung der University of Utah für K.J.W. und einem Department of Veterans Affairs Award an T.A.W. (VA I01BX0003635) finanziert. T.A.W. ist Träger des Research Career Scientist Award (IK6 BX003781) des Department of Veterans Affairs. Die Autoren möchten die redaktionelle Unterstützung von Frau Lisa Chudomelka würdigen. Die Autoren danken dem UNMC Flow Cytometry Core für ihre Unterstützung bei der Erfassung der für dieses Manuskript generierten Flow-Zytometrie-Daten.

Materials

0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 um transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 um Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 micron strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti- mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 ug/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 ug/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 ug/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 ug/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 ug/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 ug/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 ug/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 ug/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 ug/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 ug/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 ug/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C
small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

References

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Cite This Article
Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

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