Summary

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Published: September 20, 2019
doi:

Summary

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Abstract

Hierin presenteren we een efficiënte methode die kan worden uitgevoerd met elementaire laboratorium vaardigheden en-materialen om de chemokinetische beweging van lymfocyten in een ex vivo-transmigratie systeem te beoordelen. Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) en CD4+ T helper cellen werden geïsoleerd uit milt en longen van kip ei ovalbumine (OVA)-uitgedaagd Balb/c muizen. We bevestigden de uitdrukking van CCR4 op zowel CD4+ T-cellen als ILC2, relatief. CCL17 en CCL22 zijn de bekende liganden voor CCR4; Daarom onderzochten we met deze ex vivo-transmigratie methode CCL17 en CCL22-geïnduceerde beweging van CCR4+ lymfocyten. Om Chemokine gradiënten vast te stellen, werden CCL17 en CCL22 in de onderste kamer van het transmigratiesysteem geplaatst. Geïsoleerde lymfocyten werden vervolgens toegevoegd aan topkamers en over een periode van 48 uur werden de lymfocyten actief gemigreerd via 3 μm poriën naar de Chemokine in de onderste kamer. Dit is een effectief systeem voor het bepalen van de chemokinetica van lymfocyten, maar, begrijpelijkerwijs, niet nabootsen van de complexiteiten gevonden in de in vivo Organ micro-omgevingen. Dit is een beperking van de methode die kan worden overwonnen door de toevoeging van in situ beeldvorming van het orgel en lymfocyten onder studie. Het voordeel van deze methode is daarentegen dat deze kan worden uitgevoerd door een technicus op instapniveau die een veel kosteneffectiever tarief heeft dan live Imaging. Aangezien therapeutische verbindingen beschikbaar komen om de migratie te verbeteren, zoals in het geval van tumor infiltrerende cytotoxische immuuncellen, of om migratie te remmen, misschien in het geval van auto-immuunziekten waar Immunopathologie van belang is, kan deze methode worden gebruikt als een screening tool. In het algemeen is de methode effectief als de Chemokine van belang consequent chemokinetica genereert op een statistisch hoger niveau dan de media controle. In dergelijke gevallen kan de mate van remming/verbetering door een bepaalde verbinding ook worden bepaald.

Introduction

Deze oorspronkelijke transmigratie methode werd gepresenteerd door Stephen Boyden in 1962 in het tijdschrift van experimentele geneeskunde1. Veel van wat we weten over chemotaxis en chemokinetica zou niet mogelijk zijn zonder de ontwikkeling van de Boyden kamer. Voorafgaand aan de ontdekking van de eerste Chemokine in 1977, werden ex vivo-transmigratie systemen gebruikt om te leren over serum factoren die de cellulaire beweging in macrofagen konden arresteren terwijl de cellulaire beweeglijkheid in neutrofielen1,2werd vergroot. Een enorme rijkdom aan kennis is ontwikkeld met betrekking tot de immuuncelmigratie, en tot op heden, 47 chemokines zijn nu ontdekt met 19 overeenkomstige receptoren3,4. Bovendien, menigten van remmers/versterkers van deze Chemokine trajecten hebben ondergaan ontwikkeling voor therapeutische doeleinden5,6,7,8. Veel van deze verbindingen zijn getest in soortgelijke transmigratie kamers om te begrijpen van directe interacties tussen de verbindingen en immuuncellen responsiviteit op een bepaalde Chemokine9.

Transmigratie, of diapedesis, in ontstoken weefsel is een essentieel proces voor een gezonde ontstekingsreactie op heldere infectie10,11. Een Boyden kamer, transmigratiesysteem of trans Well-apparaat bestaan over het algemeen uit twee kamers, gescheiden door een poreus membraan van1,12. De onderste kamer bevat meestal media met de Chemokine van belang, terwijl leukocyten in de bovenste kamer worden geplaatst. De grootte van de porie in het membraan kan worden geselecteerd op basis van de grootte van de cel van belang. Voor dit project selecteerden we een 3 μm poreus membraan, omdat lymfoïde cellen 7-20 μm groot zijn, afhankelijk van het stadium van cellulaire ontwikkeling. Deze poriegrootte zorgt ervoor dat deze cellen niet passief door de poriën vallen, maar dat ze actief migreren naar aanleiding van de Chemokine gradiënt.

Het grote voordeel van dit protocol is de kosteneffectiviteit. In vivo is transmigratie moeilijk omdat het uitgebreide training vereist in dier hantering en chirurgie, en vaak gaat het om krachtige microscopie die niet altijd beschikbaar is voor een onderzoeker. Kostenefficiënte screening van verbindingen die bedoeld zijn om de transmigratie te verbeteren of te remmen, kan worden uitgevoerd voordat in vivo beeldvorming mogelijk is. Omdat het transmigratiesysteem strak wordt gecontroleerd, kunnen cellen aanvankelijk worden behandeld en vervolgens aan de trans well-apparatuur worden toegevoegd, of omgekeerd kan de Chemokine eerst met een Chemokine remmer worden behandeld, waarna cellen worden toegevoegd aan de trans well-apparatuur. Tot slot kunnen endotheelcellen en/of basaalmembraan proteïnen worden toegevoegd aan de onderzijde van de transwell insert 1-2 dagen voorafgaand aan het transmigratieexperiment om de betrokkenheid van deze barrière cellen in de chemokinetica te begrijpen. Nogmaals, deze manipulaties van het systeem bieden een krachtig middel om belangrijke informatie over de effectiviteit van een bepaalde compound te bepalen voor de ingewikkeldere in vivo studies.

Het gebruik van een systeem voor de transmigratie kamer is een effectieve manier om de lymfocyten mobiliteit te beoordelen onder verschillende in vivo en in vitro omstandigheden12,13,14. Hierin beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor het beoordelen van de responsiviteit van ex vivo lymfocyten op chemokinen in een transmigratiekamer. In dit voorbeeld experiment werden CD4+ T-cellen en groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) geïsoleerd van mannelijke en vrouwelijke, Balb/c-muizen na blootstelling aan OVA-allergenen. Er werd een hypothese gegenereerd dat CCR4+ CD45+ Lineage-(Lin-) ILC2 van met allergenen betwiste muizen efficiënter zou migreren naar CCL17 en CCL22 dan CCR4+ CD4+ T-helpercellen. CCL17 en CCL22 zijn chemokines die gewoonlijk worden geproduceerd door dendritische cellen en macrofagen van het m2 (allergische) fenotype, onder andere cellen, bij allergie15,16. CCL17 en CCL22 kunnen worden gezien als biomarkers van allergische ontsteking, omdat ze gemakkelijk in de longen worden gedetecteerd tijdens luchtweg exacerbaties16,17,18. Belangrijk is dat CCR4 expressie wordt verhoogd in vergelijking met onbehandelde controles, zoals blijkt uit bioinformatische gegevens die zijn gegenereerd uit ILC2 geïsoleerd van huisstofmijt behandelde dieren, en op dezelfde manier ILC2 van naïeve dieren behandeld ex vivo met IL-33 ( allergenen-bevorderend aangeboren cytokine) upregulates CCR419,20. Bovendien, volgens gegevens voor ILC2 in de database van het immunologische genoom project (www.immgen.org), CCR4 mRNA wordt sterk uitgedrukt in deze aangeboren immuuncellen. Tot op heden is er weinig bekend over de handel in ILC2 in weefsels, maar het is waarschijnlijk dat de ILC2 en CD4+ T-cellen soortgelijke chemokines en receptoren voor chemotaxis en chemokinetica gebruiken, omdat ze vergelijkbare transcriptiefactoren en receptoren uitdrukken. Zo vergeleken we CCL17 versus CCL22 responsiviteit, van ILC2 en CD4+ T-lymfocyten, van zowel mannelijke als vrouwelijke, met eicellen betwiste dieren.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn beoordeeld en goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg-en gebruiks comités van de Universiteit van Nebraska Medical Center (UNMC) en de Universiteit van Utah. 1. installatie en bereiding van reagentia Maak een complete RPMI (Roswell Park Memorial Institute) media. Voeg 10 mL warmtegeïnactiveerd foetaal serum (FBS) toe aan 90 mL RPMI. Voeg 1 mL 100x Penicillaire-streptomycine-glutamine toe aan 100 mL 10% …

Representative Results

CCR4 expressie op CD4 + T-cellen en ILC2. Voor het succes van het ex vivo transmigratie-experiment is het noodzakelijk om te bepalen of de lymfocyten reageren op CCL17 en CCL22 door middel van CCR4; Daarom bepaalden we CCR4 expressie op zowel CD4+ T-cellen als ILC2 door Flowcytometrie. Hoewel het bekend is dat OVA-specifieke CD4+ helper T cellen Express CCR4, minder is bekend van de uitdrukking van CCR4 op ILC2. Figuur 1 toon…

Discussion

Hierin presenteren we een vaste methode voor de beoordeling van Chemokine-geïnduceerde migratie van lymfocyten in een ex vivo-transmigratiesysteem. Er zijn verschillende kritische stappen in het Protocol, waarvan de eerste de uitdrukking van de juiste Chemokine receptor op de immuuncellen in het experiment verifieert. In onze handen kozen we CCR4 vanwege het lichaam van de literatuur die het belang van CCR4 op Th2 helper T cellen in allergische ontsteking benadrukt. Ovalbumine-geïnduceerde ontsteking werd eerder aanget…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de American Lung Association (K.J.W.), het Memorial Eugene Kenney Fund toegekend aan T.A.W. en K.J.W., royale start-up ondersteuning van de Universiteit van Utah voor K.J.W., en een afdeling van Veterans Affairs Award to T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. is de ontvanger van een Research Career Scientist Award (IK6 BX003781) van het departement Veterans Affairs. De auteurs willen de redactionele assistentie van mevrouw Lisa Chudomelka erkennen. De auteurs danken de unmc flow flowcytometrieonderzoeken core voor hun ondersteuning bij het verzamelen van de flow cytometrie-gegevens die voor dit manuscript zijn gegenereerd.

Materials

0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 um transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 um Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 micron strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti- mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 ug/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 ug/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 ug/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 ug/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 ug/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 ug/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 ug/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 ug/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 ug/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 ug/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 ug/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C
small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn’s and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Play Video

Cite This Article
Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

View Video