Mejorar la precisión de la evaluación citométrica de flujo del potencial de la membrana mitocondrial en células hematopoyéticas de tallo y progenitor a través de la inhibición de las bombas de eflujo
Summary
Las bombas de eflujo xenobiótico son muy activas en células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSCCP) y causan extrusión de TMRM, un tinte fluorescente potencial de membrana mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para medir con precisión el potencial de la membrana mitocondrial en los HSCCP por TMRM en presencia de Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo.
Abstract
Como el metabolismo celular es un regulador clave de la auto-renovación de células madre hematopoyéticas (HSC), los diversos papeles desempeñados por las mitocondrias en la homeostasis hematopoyética han sido ampliamente estudiados por los investigadores de HSC. Los niveles de actividad mitocondrial se reflejan en sus potenciales de membrana ( , que se pueden medir mediante colores catiónicos persignificados por células como TMRM (tetrametilrhodamina, éster metílico). Sin embargo, la capacidad de las bombas de eflujo para extruir estos tendededores de las células puede limitar su utilidad. El sesgo de medición resultante es particularmente crítico al evaluar los HSC, ya que los transportadores xenobióticos presentan niveles más altos de expresión y actividad en los HSC que en las células diferenciadas. Aquí, describimos un protocolo que utiliza Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo, para medir con precisión a través de múltiples poblaciones de médula ósea. Se ha demostrado que la inhibición resultante de la actividad de la bomba aumenta la intensidad de la TMRM en las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSPC), mientras que la deja relativamente sin cambios en fracciones maduras. Esto pone de relieve la atención cercana a la actividad de colorante-eflujo que se requiere cuando se utilizan tintes dependientes de la m, y según lo escrito y visualizado, este protocolo se puede utilizar para comparar con precisión diferentes poblaciones dentro de la médula ósea, o la misma población en diferentes modelos experimentales.
Introduction
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son auto-renovadas, multipotentes, y capaces de dar lugar a todas las células de la sangre1,2. El metabolismo celular es un regulador clave del mantenimiento de HSC, juntocon factores transcripcionales, señales intrínsecas y el microambiente 3,4,5. Por lo tanto, el control adecuado de la función y la calidad mitocondriales es fundamental para el mantenimiento de HSC6,7.
El potencial de la membrana mitocondrial es un parámetro clave en la evaluación de las mitocondrias, ya que refleja directamente su funcionalidad, que deriva del equilibrio de la actividad de bombeo de protones en la cadena de transporte de electrones y el flujo de protones a través de F 1/FO ATP sintasa. Ambos son necesarios (dependiendo de la expresión génica y la disponibilidad del sustrato) para la fosforilación dependiente del oxígeno de ADP a ATP8,9. Aprovechando la electronegatividad del compartimiento mitocondrial, se han desarrollado varios colorantes potenciométricos para medir el sistema. Uno de ellos es el perclorato de éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), que se ha utilizado ampliamente para medir la citometría de flujo en una variedad de células10,incluyendo el tallo hematopoyético y las células progenitoras11.
Los tintes mitocondriales deben utilizarse con cierta precaución en los HSC, sin embargo, porque la alta actividad de las bombas de eflujo xenobiótico de estas células puede dar lugar a la extrusión de tinte12. De hecho, la extrusión de tintes mitocondriales como Rhodamine 123 ha permitido a los investigadores aislar los HSC13 o identificar las “poblaciones laterales” de HSC explotando la extrusión diferencial de los tintes Hoechst Blue y Hoechst Red14, 15. También se ha demostrado que Fumitremorgin C, un bloqueador específico del transportador de la subfamilia G de casete de unión ATP G (ABCG2), no afecta al patrón de tinción de MitoTracker en HSPCs16. Después de la publicación de estos resultados, se realizaron múltiples estudios utilizando desies mitocondriales en ausencia de inhibidores de la bomba de eflujo xenobiótico, lo que llevó a la impresión generalizada de que los HSC tienen sólo un pequeño número de mitocondrias conbajo , 17 , 18.
Recientemente, se demostró, sin embargo, que Verapamil, un inhibidor de amplio espectro de bombas de eflujo, modifica significativamente el patrón de tinción del tinte mitocondrial MitoTracker Green19. Esta discrepancia es probablemente debido al hecho de que Fumitremorgin C es altamente selectivo para Abcg2, mientras que los HSC también expresan otros transportadores como Abcb1a (que sólo es débilmente sensible a Fumitremorgin C)19. También hemos informado de que otros colorantes mitocondriales, como TMRM, Naranja acridina Nonyl y Naranja Mitotracker (MTO) exhiben los mismos patrones que Mitotracker Green. Lo que es más importante, hemos observado que los patrones citométricos de flujo de los HSCCP reflejan su m, además de la masa mitocondrial11.
La ingesta de tinte TMRM depende estrictamente de la carga negativa de las mitocondrias, pero la acumulación resultante de tinte está en equilibrio constante entre su ingesta y el aclaramiento por las bombas de eflujo20. La diferencia en la expresión de la bomba de eflujo xenobiótico entre los HSC y las poblaciones de células maduras afecta este equilibrio y puede conducir a resultados sesgados. El uso de inhibidores específicos como Verapamil debe ser considerado en el análisis de los diques potenciométricos. Aquí describimos un protocolo modificado para la medición precisa de m-m por citometría de flujo basada en TMRM que corrige la actividad del transportador xenobiótico mediante el uso de inhibidores dedicados.
Protocol
Representative Results
Discussion
La medición del potencial de la membrana mitocondrial es una piedra angular del análisis y evaluación de las mitocondrias, que son críticas para el estado metabólico de la célula. Aquí, describimos un protocolo para el análisis de la tinción de TMRM. TMRM es un tinte fluorescente permeado por células que se acumula en las mitocondrias activas debido a los compartimentos extracelulares, citoplasmáticos y mitocondriales10. Este protocolo se puede adaptar para varios colorantes, incluyendo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a todos los miembros del laboratorio Ito, especialmente K Ito y H Sato, y al Instituto de Células Madre Einstein por sus comentarios y a las instalaciones básicas de Citometría e Imágenes Analíticas de Einstein Flow (financiadas por el Instituto Nacional del Cáncer P30 CA013330) ayudar a llevar a cabo los experimentos. K.I. cuenta con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01DK98263, R01DK115577 y R01DK100689) y del Departamento de Salud del Estado de Nueva York como Director Principal de Genómica/Eyómica de Células Simples de Einstein (C029154). K.I. Ito es un estudioso de investigación de la Sociedad de Leucemia y Linfoma.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
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