تحسين دقة التقييم السيتومتري للتدفق لإمكانات الغشاء الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف من خلال تثبيط مضخات Efflux
Summary
مضخات efflux Xenobiotic نشطة للغاية في الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف (HSPCs) وتسبب قذف TMRM، صبغة الفلورسنت غشاء الميتوكوندريا المحتملة. هنا، نقدم بروتوكول لقياس بدقة إمكانات غشاء الميتوكوندريا في HSPCs من قبل TMRM في وجود فيراباميل، مثبط مضخة efflux.
Abstract
كما التمثيل الغذائي الخلوي هو منظم رئيسي للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) التجديد الذاتي، وقد درست الأدوار المختلفة التي لعبتها الميتوكوندريا في التوازن المكونة للدم على نطاق واسع من قبل الباحثين HSC. وتنعكس مستويات نشاط الميتوكوندريا في إمكانات الغشاء (ΔM)، والتي يمكن قياسها بالأصباغ الموجبة المفترضة بالخلايا مثل TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). قدرة مضخات efflux لقذف هذه الأصباغ من الخلايا يمكن أن تحد من فائدتها، ومع ذلك. ويتسم تحيز القياس الناتج عن ذلك بأهمية بالغة عند تقييم مركبات HSCs، حيث أن الناقلين الزنيوبيين يظهرون مستويات أعلى من التعبير والنشاط في هذه المراكز مقارنة بالخلايا المتمايزة. هنا، ونحن نصف بروتوكول باستخدام فيراباميل، مثبط مضخة efflux، لقياس بدقة ΔM عبر مجموعات نخاع العظام متعددة. وتبين أن تثبيط نشاط المضخة الناتج عن ذلك يزيد من كثافة TMRM في الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs)، مع تركها دون تغيير نسبي في الكسور الناضجة. وهذا يسلط الضوء على الاهتمام الوثيق بنشاط صبغ efflux المطلوب عند استخدام الأصباغ المعتمدة على ΔM، وكما هو مكتوب وتصور، يمكن استخدام هذا البروتوكول لمقارنة بدقة إما مجموعات مختلفة داخل نخاع العظام، أو نفس السكان عبر نماذج تجريبية مختلفة.
Introduction
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي تجديد ذاتي، متعددة القوة، وقادرة على أن تؤدي إلى جميع خلايا الدم1،2. التمثيل الغذائي الخلوي هو منظم رئيسي لصيانة HSC، جنبا إلىجنب مع العوامل النسخية، والإشارات الجوهرية والبيئة الدقيقة 3،4،5. وبالتالي فإن السيطرة السليمة على وظيفة الميتوكوندريا والجودة أمر بالغ الأهمية لصيانة HSC6،7.
إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔM) هي معلمة رئيسية في تقييم الميتوكوندريا لأنها تعكس مباشرة وظائفها، والتي تستمد من توازن نشاط ضخ البروتون في سلسلة نقل الإلكترون وتدفق البروتون من خلال F 1/ Fيا ATP synthase. هذه مطلوبة على حد سواء (اعتمادا على التعبير الجيني وتوافر الركيزة) للفسفورية المعتمدة على الأكسجين من ADP إلى ATP8،9. الاستفادة من الإلكترونات من مقصورة الميتوكوندريا، وقد وضعت الأصباغ الفعالة المختلفة لقياس ΔM. واحد منهم هو رباعي ميثيل رودادومين ميثيل استر بيركلورات (TMRM)، والتي استخدمت على نطاق واسع لقياس ΔM عن طريق قياس التدفق في مجموعة متنوعة من الخلايا10، بما في ذلك الجذعية المكونة للدم وخلايا السلف11.
يجب استخدام الأصباغ الميتوكوندريا مع بعض الحذر في HSCs، ومع ذلك، لأن النشاط العالي لمضخات efflux xenobiotic من هذه الخلايا يمكن أن يؤدي إلى النتوء صبغ12. في الواقع، وقد سمح قذف الأصباغ الميتوكوندريا مثل رودامين 123 للباحثين لعزل HSCs13 أو تحديد HSC “السكان الجانب” من خلال استغلال قذف تفاضلي من الأصباغ Hoechst الأزرق وهويشت الأحمر14، 15.وقد تبين أيضا أن Fumitremorgin C، مانع محددة من ATP ملزمة كاسيت الفرعية الأسرة G عضو 2 (ABCG2) الناقل، لا يؤثر على نمط تلطيخ MitoTracker في HSPCs16. بعد نشر هذه النتائج، أجريت دراسات متعددة باستخدام الأصباغ الميتوكوندريا في غياب مثبطات مضخة efflux xenobiotic، مما أدى إلى انطباع واسع النطاق أن HSCs لديها سوى عدد قليل من الميتوكوندريا مع ΔM منخفضة16 , 17 سنة , 18.
في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، ثبت أن فيراباميل، وهو مثبط طيف واسع من مضخات efflux، يعدل بشكل كبير نمط تلطيخ صبغ الميتوكوندريا ميتوتراكر الأخضر19. هذا التباين من المرجح أن يرجع إلى حقيقة أن Fumitremorgin C انتقائية للغاية لAbcg2، في حين أن HSCs أيضا التعبير عن ناقلات أخرى مثل Abcb1a (الذي هو حساسة ضعيفة فقط لFumitremorgin C)19. وقد أبلغنا أيضا أن الأصباغ الميتوكوندريا الأخرى، مثل TMRM، نونيل أكريدين البرتقال، وميتوتراكر أورانج (MTO) تظهر نفس أنماط ميتوتراكر الأخضر. والأهم من ذلك، لاحظنا أن أنماط تدفق السيتومتري من HSPCs تعكس ΔM الخاصة بهم بالإضافة إلى كتلة الميتوكوندريا11.
يعتمد تناول صبغTMRM بشكل صارم على الشحنة السلبية من الميتوكوندريا، ولكن تراكم الصبغة الناتج عن ذلك هو في توازن ثابت بين تناولها والتخليص بواسطة مضخات efflux20. الفرق في التعبير مضخة efflux xenobiotic بين HSCs وخلايا ناضجة السكان يؤثر على هذا التوازن ويمكن أن يؤدي إلى نتائج متحيزة. وينبغي النظر في استخدام مثبطات مخصصة مثل فيراباميل في تحليل ΔM بواسطة الأصباغ الجهد. هنا نقوم بوصف بروتوكول معدل لقياس ΔM دقيقة من قبل قياس التدفق القائم على TMRM الذي يصحح لنشاط الناقل xenobiotic من خلال استخدام مثبطات مخصصة.
Protocol
Representative Results
Discussion
قياس غشاء الميتوكوندريا المحتملة هو حجر الزاوية في تحليل وتقييم الميتوكوندريا، والتي هي حاسمة للحالة الأيضية للخلية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتحليل ΔM من قبل TMRM تلطيخ. TMRM هو صبغة فلورية خلية permeant التي تتراكم في الميتوكوندريا النشطة بسبب ΔM، ومستويات كل منها لا تزال في التوازن بين المقصورات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون جميع أعضاء مختبر آيتو، ولا سيما K Ito وH Sato، ومعهد أينشتاين للخلايا الجذعية على التعليقات ومرافق قياس التدفق الخلوي والتصوير التحليلي (الممولة من المعهد الوطني للسرطان منحة P30 CA013330) ل المساعدة في إجراء التجارب. ويدعم K.I. من قبل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01DK98263, R01DK115577, و R01DK100689) ووزارة الصحة في ولاية نيويورك كمدير أساسي لعلم الجينوم أحادي الخلية /Epigenomics (C029154). K.I. Ito هو باحث في جمعية سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
