Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração
Summary
É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.
Abstract
O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias que suportam funções fisiológicas, tais como metabolismo alimentar, colheita de energia, e regulação do sistema imunológico. A perturbação do microbioma intestinal saudável tem sido sugerida para desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias, incluindo esclerose múltipla (MS). Fatores ambientais e genéticos podem influenciar a composição do microbioma; Portanto, a identificação de comunidades microbianas ligadas a um fenótipo de doença tornou-se o primeiro passo para a definição do papel do Microbiome na saúde e na doença. O uso do sequenciamento metagenomico de 16s rRNA para analisar a comunidade bacteriana tem ajudado no avanço da pesquisa de microbioma. Apesar de seu uso largo, não há nenhum protocolo uniforme para a análise de perfilação taxonômica 16S rRNA-baseada. Outra limitação é a baixa resolução da atribuição taxonômica devido a dificuldades técnicas, como leituras de sequenciamento menores, bem como o uso de apenas leituras Forward (R1) na análise final devido à baixa qualidade de leituras inversas (R2). Há necessidade de um método simplificado com alta resolução para caracterizar a diversidade bacteriana em um dado bioespécime. Os avanços na tecnologia de sequenciamento com a capacidade de sequenciar leituras mais longas em alta resolução ajudaram a superar alguns desses desafios. A tecnologia de sequenciamento atual combinada com um pipeline de análise metagenômica disponível publicamente, como o R-based divisive amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2), ajudou a avançar o perfil microbiano em alta resolução, pois DADA2 pode atribuir a sequência no gênero e níveis de espécies. Descrito aqui é um guia para a realização de perfis bacterianos usando a amplificação em duas etapas da região v3-v4 do gene 16S rRNA, seguido pela análise usando ferramentas de análise disponíveis livremente (i.e., DADA2, Phyloseq, e METAGENassist). Acredita-se que este fluxo de trabalho simples e completo servirá como uma excelente ferramenta para pesquisadores interessados em realizar estudos de perfilamento de microbioma.
Introduction
A microbiota refere-se a uma coleção de microrganismos (bactérias, vírus, archaea, bacteriófagos e fungos) vivendo em um ambiente particular, e o microbioma refere-se ao genoma coletivo de microrganismos residentes. Como as bactérias são um dos micróbios mais abundantes em humanos e camundongos, este estudo é focado apenas no perfil bacteriano. O intestino humano é colonizado por trilhões de bactérias e centenas de cepas bacterianas1. A microbiota intestinal normal desempenha um papel vital na manutenção de um estado saudável no hospedeiro, regulando as funções (ou seja, a manutenção de uma barreira do intestino intacto, metabolismo alimentar, homeostase energética, inibição da colonização por organismos patogénicos, e regulação das respostas imunes)2,3,4,5. As perturbações composicional da microbiota intestinal (disbiose intestinal) têm sido ligadas a uma série de doenças humanas, incluindo distúrbios gastrointestinais6, obesidade7,8, acidentevascular cerebral9, câncer10, diabetes8,11, artrite reumatóide12, alergias13, e doenças relacionadas ao sistema nervoso central, tais como esclerose múltipla (MS)14,15e Alzheimer doença (AD)8,16. Portanto, nos últimos anos, tem havido crescente interesse em ferramentas para identificar a composição bacteriana em diferentes locais do corpo. Um método confiável deve ter características como ser de alta produtividade e fácil de usar, ter a capacidade de classificar a microbiota bacteriana com alta resolução, e ser de baixo custo.
Técnicas microbiológicas baseadas na cultura não são sensíveis o suficiente para identificar e caracterizar o complexo microbioma intestinal devido à falha de várias bactérias intestinais para crescer na cultura. O advento da tecnologia baseada em sequenciamento, especialmente o seqüenciamento metagenomico baseado em rRNA 16s, superou alguns desses desafios e transformou a pesquisa em microbioma17. A avançada tecnologia de sequenciamento 16S rRNA tem ajudado a estabelecer um papel crítico para o microbioma intestinal na saúde humana. O projeto do microbioma humano, uma iniciativa nacional dos institutos de saúde18, e o projeto metahit (uma iniciativa européia)19 ajudaram a estabelecer um quadro básico para a análise do microbioma. Essas iniciativas ajudaram a iniciar vários estudos para determinar o papel do microbioma intestinal na saúde humana e na doença.
Vários grupos demonstraram disbiose intestinal em pacientes com doenças inflamatórias12,14,15,20,21,22. Apesar de ser amplamente utilizado para o perfilamento taxonômico devido à capacidade de multiplex e de baixos custos, não há nenhum protocolo uniforme para o perfilamento taxonômico 16S rRNA-baseado. Outra limitação é a baixa resolução da atribuição taxonômica devido às leituras de seqüenciamento menores (150 BP ou 250 BP) e o uso de apenas seqüenciamento de encaminhamento lido (R1) devido a leituras de seqüenciamento reverso de baixa qualidade (R2). No entanto, os avanços na tecnologia de sequenciamento ajudaram a superar alguns desses desafios, como a capacidade de sequenciar leituras mais longas usando leituras de extremidade emparelhada (por exemplo, Illumina MiSeq 2x300bp).
A tecnologia de sequenciamento atual pode sequenciar 600 BP leituras de boa qualidade, que permite a mesclagem de leituras R1 e R2. Essas leituras de R1 e R2 mais longas mescladas permitem melhores atribuições taxonômicas, especialmente com a plataforma de acesso livre com base em R divisive amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2). DADA2 utiliza atribuições baseadas em variante de sequência de amplicon (ASV) em vez de atribuições de unidade taxonômica operacional (OTU) com base na similaridade de 97% utilizada pelo QIIME23. As correspondências do ASV resultam em uma correspondência exata de sequência no banco de dados dentro de 1 a 2 nucleotídeos, o que leva à atribuição em níveis de gênero e espécie. Assim, a combinação de leituras mais longas, de boa qualidade pareadas e melhores ferramentas de atribuição taxonômica (como DADA2) transformaram estudos de microbioma.
Fornecido aqui é um guia passo-a-passo para a realização de perfis bacterianos usando a amplificação em duas etapas da região v3-v4 de rRNA 16S e análise de dados usando DADA2, Phyloseq e METAGENassist pipelines. Para este estudo, os camundongos transgênicos de classe II de Antígeno leucocitário humano (HLA) são usados, pois certos alelos HLA classe II estão vinculados a uma predisposição a doenças auto-imunes, como a MS20,24,25. Entretanto, a importância de genes da classe II de HLA em regular a composição da microbiota do intestino é desconhecida. Hipótese que a molécula da classe II de HLA influenciará a comunidade microbiana do intestino selecionando para bactérias específicas. Os camundongos Knockout de classe II (AE. ko) ou camundongos que expressam moléculas HLA-DQ8 humanas (HLA-DQ8)24,25,26 foram usados para compreender a importância das moléculas HLA classe II em moldar a comunidade microbiana do intestino. Acredita-se que este fluxo de trabalho completo e simplificado com análise de dados baseada em R servirá como uma excelente ferramenta para pesquisadores interessados em realizar estudos de perfilamento de microbioma.
A geração de camundongos que faltam genes de classe II Murina endógena de MHC (AE. KO) e AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * (HLA-DQ8) camundongos transgênicos com um fundo C57BL/6J tem sido descrito anteriormente26. Amostras fecais são coletadas de camundongos de ambos os sexos (8 – 12 semanas de idade). Os camundongos foram previamente criados e mantidos na instalação animal da Universidade de Iowa de acordo com o NIH e as diretrizes institucionais. Estratégias de controle de contaminação, como o desmame dos camundongos dentro de um armário de fluxo laminar, a mudança de luvas entre diferentes cepas de camundongos, e a manutenção adequada de camundongos são passos críticos para o perfilamento do microbioma intestinal.
O equipamento de proteção individual (EPI) adequado é altamente recomendado durante todo o procedimento. Controles negativos apropriados devem ser incluídos na realização de isolamento de DNA, amplificação PCR1 e PCR2 e etapas de sequenciamento. Recomenda-se o uso de suprimentos estéreis, livres de DNase, RNase e sem Pirogênios. O pipetador designado para o trabalho do microbioma e as pontas filtradas da pipeta devem ser usados durante todo o protocolo. A análise da microbiota consiste em sete etapas: 1) coleta e processamento de amostras fecais; 2) extração de DNA; 3) amplificação do gene 16S rRNA; 4) construção da biblioteca do ADN usando o PCR indexado; 5) limpeza e quantificação de PCR indexada (biblioteca); 6) sequenciamento de MiSeq; e 7) processamento de dados e análise de sequências. Um diagrama esquemático de todas as etapas do protocolo é mostrado na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito é simples, com etapas fáceis de seguir para executar o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica de 16s rRNA de um grande número bioespécimes do interesse. O sequenciamento da próxima geração transformou estudos de ecologia microbiana, especialmente em modelos de doenças humanas e pré-clínicas31,32. A principal vantagem desta técnica é a sua capacidade de analisar com sucesso composições microbianas comple…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o financiamento do NIAID/NIH (1R01AI137075-01), o Carver Trust Medical Research Initiative Grant, e do centro de pesquisa de ciências ambientais de saúde da Universidade de Iowa, NIEHS/NIH (p30 ES005605).
Materials
| 1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
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