2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析
Summary
ここでは、自由に利用可能なツールを使用して16S rRNAメタゲノムシーケンシングおよび分析を使用したマイクロバイオームプロファイリングの簡略化された標準的な操作手順を説明します。このプロトコルは、マイクロバイオーム分野に新しい研究者だけでなく、より高い解像度で細菌プロファイリングを達成するための方法の更新を必要とする研究者を支援します。
Abstract
人間の腸は、食物代謝、エネルギー収穫、免疫系の調節などの生理学的機能をサポートする細菌の兆によって植民地化されています。健康な腸内微生物叢の摂動は、多発性硬化症(MS)を含む炎症性疾患の発症に役割を果たすることが示唆されている。環境および遺伝的要因は、マイクロバイオームの組成に影響を与えることができます。したがって、疾患表現型と関連する微生物群の同定は、健康と疾患における微生物叢の役割を定義するための第一歩となっている。細菌コミュニティのプロファイリングのための16S rRNAメタゲノムシーケンシングの使用は、マイクロバイオーム研究の進めに役立ちました。広い使用にもかかわらず、16S rRNAベースの分類プロファイリング分析のための均一なプロトコルはありません。もう 1 つの制限は、シーケンス読み取りの小ささなどの技術的な問題による分類割り当ての低解像度と、リバース (R2) 読み取りの品質が低いため、最終分析でのフォワード (R1) 読み取りのみの使用です。所定の生体試料中の細菌多様性を特徴付ける高解像度の方法が必要である。高解像度でより長い読み取りをシーケンスする機能を備えたシーケンシング技術の進歩は、これらの課題のいくつかを克服するのに役立ちました。現在のシーケンシング技術と、Rベースの分裂アンプリコンデノイズアルゴリズム-2(DADA2)などの一般に利用可能なメタゲノム解析パイプラインを組み合わせることで、DADA2は属でシーケンスを割り当てることができるため、高解像度で微生物プロファイリングを進めるのに役立っています。と種のレベル。ここでは、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域の2段階増幅を用いて細菌プロファイリングを行うためのガイドであり、その後、自由に利用可能な分析ツール(すなわち、DADA2、Phyloseq、およびMETAGENassist)を用いた分析を行う。このシンプルで完全なワークフローは、マイクロバイオームプロファイリング研究を行うことに興味を持つ研究者のための優れたツールとして役立つと考えられています。
Introduction
微生物叢は、特定の環境に生息する微生物(細菌、ウイルス、考古学、細菌、真菌)の集合体を指し、微生物叢は常在微生物の集合ゲノムを指す。細菌はヒトとマウスで最も豊富な微生物の一つであり、この研究は細菌プロファイリングのみに焦点を当てています。人間の腸は何兆もの細菌と何百もの細菌株1によって植民地化される。正常な腸内微生物叢は、機能を調節することによって宿主の健康な状態を維持する上で重要な役割を果たしている(すなわち、無傷の腸バリアの維持、食物代謝、エネルギー恒常性、病原性生物による植民地化の阻害、および免疫応答の調節)2,3,4,5.腸内微生物叢の組成摂動(腸ジビオシス)は、胃腸障害6、肥満7、8、脳卒中9、癌10を含む多くのヒト疾患にリンクされている。糖尿病8,11,関節リウマチ12,アレルギー13,多発性硬化症(MS)14,15およびアルツハイマー病などの中枢神経系関連疾患病気 (AD)8,16.そこで、近年、異なる身体部位で細菌組成を同定するツールへの関心が高まっている。信頼性の高い方法は、高スループットと使いやすい、高分解能で細菌微生物叢を分類する能力を有し、低コストであることなどの特性を有する必要があります。
培養に基づく微生物学的手法は、培養中に成長するいくつかの腸内細菌の不全に起因する複雑な腸内微生物叢を同定し、特徴付けるのに十分な感受性を持たない。シーケンシングベースの技術、特に16S rRNAベースのメタゲノムシーケンシングの出現は、これらの課題のいくつかを克服し、マイクロバイオーム研究17を変換しました。高度な16S rRNAベースのシーケンシング技術は、ヒトの健康における腸内微生物叢の重要な役割を確立するのに役立ちました。ヒューマン・マイクロバイオーム・プロジェクト、国立衛生研究所イニシアティブ18、MetaHITプロジェクト(欧州イニシアティブ)19は、いずれもマイクロバイオーム分析の基本的な枠組みの確立に貢献しています。これらのイニシアチブは、ヒトの健康と病気における腸内微生物叢の役割を決定するために、複数の研究を開始するのに役立ちました。
多くのグループは、炎症性疾患12、14、15、20、21、22の患者において腸ジスビオシスを示している。多重化および低コストの能力のために分類プロファイリングのために広く使用されているにもかかわらず、16S rRNAベースの分類プロファイリングのための統一されたプロトコルはありません。もう 1 つの制限は、シーケンス読み取り(150 bp または 250 bp)が小さく、低品質の逆シーケンス読み取り (R2) による前方シーケンス読み取り (R1) のみの使用による分類割り当ての低解像度です。しかし、シーケンシング技術の進歩は、ペアエンドの読み取り(例えば、Illumina MiSeq 2x300bp)を使用して長い読み取りをシーケンスする機能など、これらの課題のいくつかを克服するのに役立ちました。
現在のシーケンシング技術は、R1とR2の読み取りをマージすることができ、600 bpの良質の読み取りをシーケンスすることができます。これらのマージされた長いR1とR2の読み取りは、特にオープンアクセスのRベースのディバイシスアンプリソンデノイズアルゴリズム-2(DADA2)プラットフォームで、より良い分類割り当てを可能にします。DADA2は、QIIME23で利用される97%の類似性に基づいて、操作分類単位(OTU)割り当ての代わりにアンプリコン配列バリアント(ASV)ベースの割り当てを利用します。ASVの一致は、1~2ヌクレオチド内のデータベース内の完全な配列一致をもたらし、属および種レベルでの割り当てにつながる。したがって、より長く、良質のペアエンド読み取りとより良い分類割り当てツール(DADA2など)の組み合わせは、マイクロバイオーム研究を変革しました。
ここでは、16S rRNAのV3-V4領域の2段階増幅とDADA2、Phyloseq、METAGENassistパイプラインを使用したデータ解析を使用して細菌プロファイリングを実行するためのステップバイステップガイドを提供します。本研究では、ヒト白血病抗原(HLA)クラスIIトランスジェニックマウスが用いられるが、特定のHLAクラスII対照体がMS20、24、25などの自己免疫疾患の素因と連結される。しかしながら、腸内微生物叢の組成を調節する上でのHLAクラスII遺伝子の重要性は不明である。HLAクラスII分子は、特定の細菌を選択することによって腸内微生物コミュニティに影響を与えると仮定される。主組織適合性錯視(MHC)クラスIIノックアウトマウス(AE.KO)またはヒトHLA-DQ8分子を発現するマウス(HLA-DQ8)24、25、26においてHLAクラスII分子の重要性を理解するために用いた。腸内微生物コミュニティを形成する。Rベースのデータ分析を用いたこの完全で簡素化されたワークフローは、マイクロバイオームプロファイリング研究に興味を持つ研究者にとって優れたツールになると考えられています。
内因性マウスMHCクラスII遺伝子(AE.KO)およびAE-/-を欠くマウスの生成。HLA-DQA1*0103、DQB1*0302(HLA-DQ8)C57BL/6J背景を有するトランスジェニックマウスは、前述の26。胎児サンプルは、両方の性別(8-12週齢)のマウスから採取される。マウスは、NIHおよび制度ガイドラインに従事し、アイオワ大学の動物施設で以前に飼育および維持された。層流キャビネット内のマウスの引き取り、マウスの異なる株間の手袋の交換、およびマウスの適切な維持などの汚染制御戦略は、腸内微生物叢のプロファイリングのための重要なステップです。
適切な個人用保護具(PPE)は、手順全体の間に強くお勧めします。DNA分離、PCR1およびPCR2増幅、およびシーケンシングステップを実行する際には、適切な負のコントロールを含める必要があります。無菌、DNaseフリー、RNaseフリー、パイロゲンフリーの使用をお勧めします。マイクロバイオーム作業および濾過されたピペットの先端のための指定されたピペットは、プロトコル全体で使用されるべきです。微生物叢分析は7つのステップで構成されています:1)fecalサンプルの収集と処理;2)DNAの抽出;3) 16S rRNA遺伝子増幅;4)インデックス付きPCRを使用したDNAライブラリ構築;5)インデックス付きPCR(ライブラリ)のクリーンアップと定量。6) ミセックシーケンス;7)データ処理とシーケンス分析。すべてのプロトコル ステップの概略図を図 1 に示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたプロトコルは簡単で、目的の多数の生体標本から16S rRNAメタゲノムシーケンシングを使用してマイクロバイオームプロファイリングを実行するための簡単な手順を用いられます。次世代シーケンシングは、特にヒトおよび前臨床疾患モデル31,32において、微生物生態学研究を変革した。この技術の主な利点は、高スループットレベルおよ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、NIAID/NIH(1R01AI137075-01)、カーバートラスト医学研究イニシアチブ助成金、アイオワ大学環境保健科学研究センター(NieHS/NIH(P30 ES005605)からの資金提供を認めている。
Materials
| 1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
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