Het doel van dit protocol is het opsporen van verschillende Clostridium perfringens toxinotypes in lokaal aangekochte voedingsmiddelen, in het bijzonder Epsilon toxine die stam types B en D produceren, zonder het gebruik van anaerobe kamers.
Clostridium perfringens (C. perfringens) is een productieve toxine producent en veroorzaakt een breed scala aan ziekten in verschillende hosts. C. perfringens is onderverdeeld in vijf verschillende toxinotypes, A tot en met E, gebaseerd op het vervoer van vier belangrijke toxine genen. De prevalentie en distributie van deze verschillende toxinotypes is onderonderzocht, vooral hun alomtegenwoordige levensmiddelen in de Amerikaanse retail. Van bijzonder belang voor ons zijn de type B-en D-stammen, die Epsilon-toxine produceren, een extreem dodelijk toxine dat wordt voorgesteld om de milieu-trigger van multiple sclerose bij mensen te zijn. Om de aanwezigheid van verschillende C. perfringens toxinotypes in verschillende voedselmonsters te evalueren, ontwikkelden we een eenvoudige methode om deze bacteriën selectief te kweken zonder het gebruik van een anaerobe containersysteem waarbij slechts drie kweek stappen werden uitgevoerd. Voedsel wordt gekocht bij lokale kruidenierszaken en vervoerd naar het laboratorium onder omgevingscondities. De monsters worden fijngemalen en geënt in gemodificeerde Rapid perfringens media (RPM) en worden gedurende een nacht bij 37 °C geïncubeerd in een verzegelde, luchtdichte conische buis. ‘S nachts culturen worden geënt op een onderlaag van massief Tryptose sulfieten Cycloserine (TSC) agar, en vervolgens overgelegd met een toplaag van gesmolten TSC agar, het creëren van een “ingeklemde”, anaerobe omgeving. Agar-platen worden ‘s nachts geïnventariseerd bij 37 °C en vervolgens geëvalueerd op de verschijning van zwarte, sulfiet-reducerende kolonies. C. perfringens-vermoedelijke kolonies worden uit de TSC agar verwijderd met behulp van steriele oogdruppels, en geënt in rpm en ondergekweekt ‘s nachts bij 37 ° c in een luchtdichte conische buis. DNA wordt geëxtraheerd uit de RPM-subcultuur en vervolgens geanalyseerd op de aanwezigheid van C. perfringens toxine genen via de polymerase kettingreactie (PCR). Afhankelijk van het type van de bemonsterde voeding is doorgaans 15 – 20% van de monsters positief voor C. perfringens.
Clostridium perfringens (C. perfringens) is een gram positieve, anaerobe, sporenvormende, staafvormige bacterie die alomtegenwoordig wordt aangetroffen in de omgeving. Deze soort bacteriën draagt genen die coderen voor meer dan 17 toxines en, historisch gezien, is gekenmerkt in vijf toxinotypes (A-E) op basis van de aanwezigheid van vier verschillende toxine genen: alpha, beta, Epsilon, en Iota toxine (tabel 1)1. Onlangs is geopperd dat dit type schema moet worden uitgebreid met de soorten F en G, die de C. perfringens enterotoxine (CPE) en netb toxine, respectievelijk2, bevatten. Echter, meer onderzoek is nodig voordat dit schemerende systeem formeel wordt aanvaard. Hoewel het Alfa toxine-gen strikt chromosomaal is gelegen, kan het CPE-gen zowel op het chromosoom als op de plasmiden worden aangetroffen. Ter vergelijking, de overgebleven toxines ‘ genen zijn te vinden op verschillende grootte plasmiden. We zijn vooral geïnteresseerd in de prevalentie van C. perfringens types B en D omdat deze stammen Epsilon toxine produceren, een zeer krachtige, Pore-vormende toxine, die is gesuggereerd om een rol te spelen bij het triggeren van multiple sclerose (MS) bij mensen3 ,4,5,6,7. Hoe mensen worden geïnfecteerd of gekoloniseerd door deze stammen is onbekend. Een mogelijke verklaring is de consumptie van besmette voedingsmiddelen. Om deze vraag te helpen beantwoorden, probeerden we de prevalentie van verschillende C. perfringens toxinotypes in Amerikaanse voedselmonsters te bepalen.
De aanwezigheid van C. perfringens toxinotypes in Amerikaanse voedselmonsters is onderbestudeerd en vereist vaak het gebruik van anaerobe containersystemen en tal van subculturing stappen8,9,10,11 . Hoewel er talrijke subculturing stappen nodig zijn om gezuiverde isolaten te verkrijgen, kan deze methode leiden tot verlies van plasmiden na verloop van tijd12,13,14, wat mogelijk gevolgen heeft voor de detectie van plasmide-overgedragen toxine genen met inbegrip van het epsilon toxine gen. We probeerden een eenvoudige methode te ontwikkelen, met minder subculturing stappen, om selectief cultuur C. perfringens zonder het gebruik van anaerobe kamers, potten of zakken. Kort, voedselmonsters worden geënt in snelle perfringens media (RPM) ‘s nachts (aan), vervolgens “ingeklemd” in TSC agar en geïncubeerd. Kolonies waarvan vermoed wordt dat ze C. perfringens zijn, worden vervolgens in rpm gecultibeerd en opnieuw geïnineerd. DNA wordt geëxtraheerd en PCR uitgevoerd om genotype te bepalen (Figuur 1). We kozen ervoor om RPM te gebruiken, omdat het is aangetoond dat het de terugwinning van C. perfringens stammen uit voedselmonsters verhoogt in vergelijking met andere meer standaard media15. Bovendien werd RPM met succes gebruikt om een Epsilon-toxine te isoleren die type B-stam van een MS-patiënt4produceerde. We gebruiken een aangepaste versie van RPM in plaats van de originele versie om eenvoudige DNA-extractie mogelijk te maken. Hoewel met deze methode een eenvoudige identificatie van toxine genen binnen monsters mogelijk is, kan het voorkomen dat een afzonderlijk monster meer dan één C. perfringens toxinotype bevat. Omdat onze methode gezuiverde stammen met behulp van meerdere zuiverings rondes niet isoleert, is identificatie van meervoudige toxinotypes uit één monster niet mogelijk. Standaard reinigingstechnieken (meestal strepen op TSC-platen of bloedagar platen) kunnen echter aan het einde van ons protocol worden toegepast om gezuiverde culturen te bereiken.
Hier beschrijven we een methode om C. perfringens prevalentie in detailhandel voedselmonsters met beperkte kweken en zonder gebruik van een anaerobe kamer systeem te identificeren. Deze methode gebruikt een combinatie van technieken om de identificatie van C. perfringens uit voedselmonsters te verhogen. Door gebruik te maken van een gemodificeerde versie van RPM media, zorgen we voor de selectieve groei van C. perfringens. Door het ingeënt toerental tussen de lagen van TSC agar te fixeren, kunnen we anaerobe, sulfiet-reducerende bacteriën identificeren en isoleren die kenmerkend zijn voor C. perfringens. Om de aanwezigheid van C. perfringenste bevestigen, worden sulfieten-reducerende kolonies gesubcultureerd in vers toerental. De gemodificeerde versie of RPM stelt ons in staat om eenvoudig DNA uit culturen te halen, waardoor PCR-bevestiging van specifieke toxine genen mogelijk is. Bevestiging van C. perfringens besmette voedselmonsters kunnen binnen drie dagen worden bereikt.
In vroege experimenten werden voedselmonsters eenvoudigweg geënt in RPM en DNA geëxtraheerd uit op culturen. Deze methode resulteerde in de detectie van C. perfringens in een beperkt aantal monsters (gegevens niet weergegeven). Hoewel RPM selectief is voor c. perfringens groei, is het niet exclusief voor c. perfringens groei. Andere, gram-positieve, D-cycolserine resistente bacteriën kunnen nog steeds groeien in RPM. We veronderstellen dat besmetting door andere bacteriesoorten onze detectie van C. perfringens -stammen kan verminderen door de gevoeligheid van onze PCR-analyse te verlagen in onze eerste on-rpm-cultuur. Een belangrijke stap in het verhogen van de detectie van C. perfringens was het opnemen van de TSC agar “sandwich”-techniek. Hierdoor konden we differentiëren en selecteren voor anaerobe, sulfieten-reducerende kolonies, kenmerkend voor C. perfringens. Een belangrijke stap in dit proces is ervoor te zorgen dat de bovenste laag van gesmolten TSC agar op 40 °C ligt. Hoewel sommige C. perfringens stammen kunnen groeien bij verhoogde temperaturen (46 – 48 °c)15,16, toevoeging van gesmolten agar bij verhoogde temperaturen vermindert de hoeveelheid culturen, meestal waarschijnlijk als gevolg van celdood .
Er zijn verschillende mogelijke beperkingen voor deze methode. Zoals eerder vermeld, selecteert of differentieert noch de RPM noch TSC agar voor C. perfringens uitsluitend, waardoor de groei van andere bacteriesoorten aanwezig in voedselmonsters mogelijk is. Dit kan de gevoeligheid van de test beperken om alleen C. perfringens te selecteren. Echter, dit is een gemeenschappelijke beperking in bijna alle kweektechnieken. Genotypbevestiging van gezuiverde isolaten is de beste methode voor het definitief identificeren van C. perfringens en andere bacteriesoorten. Een andere beperking van deze studie is dat we de gezuiverde isolaten niet testen. We hebben dit opzettelijk gedaan om de hoeveelheid kweken te beperken, omdat herhaalde kweken wordt gevreesd om te resulteren in plasmide verlies. Omdat we niet isoleren tot zuiverheid, is het mogelijk dat meerdere C. perfringens toxinotypes aanwezig kunnen zijn in hetzelfde monster of dezelfde subcultuur. Als onderzoekers gezuiverde isolaten willen verkrijgen, kunnen standaard zuiverings methoden worden gebruikt op de laatste RPM-cultuur die in deze methode wordt beschreven; Dit vereist meestal het gebruik van anaerobe kamers. Hoewel oorspronkelijk gebruikt om c. perfringens te isoleren van voedsel, kan deze methode worden gebruikt om c. perfringens te identificeren en te isoleren uit een veelheid van bronnen. Specifiek, een dergelijke toepassing van deze methode is het testen van fecale monsters van mensen (of dieren) waarvan vermoed wordt dat ze besmet zijn met C. perfringens en toxinotype de bacteriën om de bron van infectie beter te begrijpen.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek heeft geen specifieke financiering ontvangen van de sectoren Public, Commercial of not-profit.
D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
Dry Incubator | any brand | ||
Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
Individual Primers | Invitrogen | ||
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
microcentrifuge tube | any brand | ||
parafilm or plastic wrap | any brand | ||
Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
Sterile Cell Scraper | any brand | ||
Sterile cell Spreader | any brand | ||
Sterile petri dishes | any brand | ||
Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
table top centrifuge | any brand | ||
Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
water bath | any brand | ||
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |