该协议的目的是检测当地购买食品中不同的梭菌毒素毒素,特别是产生B型和D型的乙酸毒素,而无需使用厌氧室。
梭菌(C.perfringens)是一种多产的毒素生产商,在各种宿主中引起多种疾病。C. perfringes根据四个主要毒素基因的传递,分为五种不同的毒素类型,A 到 E。这些各种技术类型的流行和分布研究不足,尤其是它们在美国零售食品中的普遍性。我们特别感兴趣的是B型和D型菌株,它们产生epsilon毒素,一种极其致命的毒素,被认为是人类多发性硬化症的环境诱因。为了评估各种食物样本中是否存在不同的C.perfringens至上型,我们开发了一种简单的方法,可以选择性地培养这些细菌,而无需使用厌氧容器系统,只涉及三个培养步骤。食品从当地杂货店购买,并在环境条件下运送到实验室。样品被切碎,接种到经过修饰的快速渗透介质(RPM)中,在37°C的密封、气密锥形管中孵育过夜。隔夜培养物接种到固体胰子酶素(TSC)琼脂素(TSC)琼脂素(TSC)的底层,然后覆盖在熔融TSC琼脂的顶层,形成”夹心层”的厌氧环境。Agar板在37°C下孵育过夜,然后评估黑色、亚硫酸盐减少菌落的外观。C. Perfringens– 怀疑菌落使用无菌眼滴器从TSC琼脂中取出,并在37°C的气密锥形管中接种到RPM和亚培养中过夜。从RPM亚培养中提取DNA,然后通过聚合酶链反应(PCR)分析C.perfringens毒素基因是否存在。根据所取样的食物类型,通常有15-20%的样本对C.perfringens检测呈阳性。
克氏菌(C.perfringens)是一种在环境中随处可见的克拉姆阳性、厌氧、孢子形成、棒状细菌。这种细菌携带基因编码超过17种毒素,历史上,根据四种不同的毒素基因的存在,被定性为五种毒素类型(A-E):α、β、epsilon和iota毒素(表1)1。最近,有人建议,这种打字方案需要扩大,包括类型F和G,其中分别含有C.perfringens肠毒素(CPE)和NetB毒素,分别为2。然而,在正式接受这一阴谋系统之前,还需要进行更多的研究。虽然α毒素基因是严格地染色体定位,CPE基因可以在染色体和质粒上找到。相比之下,剩余的毒素基因发现于各种大小不同的质粒上。我们特别感兴趣的是B型和D型的C.perfringens的流行,因为这些菌株产生一种非常有效的孔隙毒素,一种非常有效的孔隙形成毒素,有人建议在人类中触发多发性硬化症(MS)的作用3 ,4,5,6,7.人们如何被这些菌株感染或殖民是未知的。一个可能的解释是食用受污染的食品。为了帮助回答这个问题,我们试图确定美国食品样本中不同C.perfringes的雄基类型的流行程度。
美国食品样品中存在C.perfringens至氧化剂,研究不足,往往需要使用厌氧容器系统和大量亚培养步骤8、9、10、11.虽然需要许多亚培养步骤来获得纯化的分离物,但这种方法可能导致质粒在12、13、14段时间内流失,从而可能影响质粒传播毒素基因的检测包括西隆毒素基因我们寻求开发一种简单的方法,用更少的亚培养步骤,有选择地培养C. perfringes,而无需使用厌氧室、罐子或袋子。简单地说,食物样本在一夜之间接种到快速Perfringens介质(RPM)中(ON),然后”夹”入TSC琼脂并孵化。被怀疑为C.perfringes的菌落随后被亚培养到RPM中,并再次孵育。脱氧核糖核酸提取和PCR执行以确定基因型(图1)。我们选择使用RPM,因为它已被证明,以增加从食品样品中C.perfringens菌株的回收量相比,其他更标准的介质15。此外,RPM还成功地用于从MS患者4中分离出产生B型菌株的Epsilon毒素。我们使用经过修改的 RPM 版本而不是原始版本,以便轻松提取 DNA。虽然这种方法允许在样本中轻松识别毒素基因,但单个样本可能含有多个C. perfringes毒素类型。由于我们的方法不使用多轮纯化分离纯化菌株,因此无法从一个样品中识别多个毒体型。然而,标准纯化技术(通常条纹到TSC板或血琼脂板)可以在我们的协议结束时应用,以实现纯化培养。
在这里,我们描述了一种方法,以确定零售食品样品中C. perfringes的流行,其亚培养有限,并且不使用厌氧室系统。该方法使用多种技术的组合来增加从食品样品中识别C.perfringens。通过使用改进版本的 RPM 介质,我们允许C. perfringes的选择性增长。通过将接种的RPM夹在TSC琼脂层之间,我们能够识别和分离厌氧、亚硫酸盐还原的细菌特性。为了确认C.perfringes的存在,亚化亚培养亚培养成新的RPM。改性版本或 RPM 使我们能够轻松地从培养物中提取 DNA,从而能够确认特定毒素基因的 PCR。三天内即可确认C.perfringes污染食品样本。
在早期实验中,食物样本被简单地接种到RPM和从ON培养物中提取的DNA中。此方法导致在有限数量的样本(未显示数据)中检测C. perfringes。虽然 RPM 是选择性的 C. perfringes增长, 它不是排他性的C. perfringes增长.其他,克阳性,D-环素耐药细菌仍然可以在RPM中生长。我们假设其他细菌物种的污染可能降低了我们在第一个 ON RPM 培养中 PCR 分析的灵敏度,从而降低了我们对C. perfringes菌株的检测。增加C.perfringens检测的一个关键步骤是纳入了TSC琼脂”三明治”技术。这使我们能够区分和选择厌氧,亚硫酸盐减少菌落,C. perfringens的特征。此过程的一个关键步骤是确保熔融 TSC 琼脂的顶层温度为 40°C。虽然一些C.perfringens菌株可以在增加的温度(46-48°C)15,16,添加熔融琼脂在增加的温度大大降低恢复的培养物的数量,主要可能是由于细胞死亡.
此方法存在几个潜在的限制。如前所述,RPM 和 TSC agar 均不专门选择或区分C. perfringens,从而允许食物样本中存在的其他细菌物种的生长。这可能降低测定的灵敏度,以便仅选择C. perfringes。然而,这是几乎所有栽培技术的一个常见限制。纯化分离物的基因分型确认是明确识别C.perfringens和其他细菌物种的最佳方法。这项研究的另一个限制是,我们不测试纯化的隔离物。我们特意这样做来限制亚培养的数量,因为反复的亚培养令人担心会导致质粒损失。由于我们不分离到纯度,有可能在同一样品或亚培养中存在多个C. perfringes toxinotype。如果研究人员希望获得纯化的分离物,标准纯化方法可用于该方法所述的最后RPM培养;这通常需要使用厌氧室。虽然最初用于从食物中分离C. perfringes,但此方法可用于从多种来源中识别和分离C. perfringes。具体来说,这种方法的一个应用是检测人类(或动物)的粪便样本,这些样本被怀疑感染了C. perfringes,并对细菌进行管灭,以更好地了解感染源。
The authors have nothing to disclose.
这项研究没有得到任何来自公共、商业或非盈利部门的具体资助。
D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
Dry Incubator | any brand | ||
Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
Individual Primers | Invitrogen | ||
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
microcentrifuge tube | any brand | ||
parafilm or plastic wrap | any brand | ||
Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
Sterile Cell Scraper | any brand | ||
Sterile cell Spreader | any brand | ||
Sterile petri dishes | any brand | ||
Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
table top centrifuge | any brand | ||
Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
water bath | any brand | ||
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |