Summary

Metodo Ex Vivo per valutare la motilità spontanea del tratto riproduttivo del mouse e un algoritmo di tracciamento del movimento uterico basato su MATLAB per l'analisi dei dati

Published: September 01, 2019
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Summary

Le contrazioni uterine sono importanti per il benessere delle femmine. Tuttavia, la contrattilità patologicamente aumentata può provocare dismenorrea, specialmente nelle femmine più giovani. Qui, descriviamo una semplice preparazione ex vivo che consente una rapida valutazione dell’efficacia dei rilassanti muscolari lisci che possono essere utilizzati per il trattamento della dismenorrea.

Abstract

La dismenorrea, o crampi dolorosi, è il sintomo più comune associato alle mestruazioni nelle femmine e la sua gravità può ostacolare la vita quotidiana delle donne. Qui, presentiamo un metodo facile ed economico che sarebbe strumentale per testare nuovi farmaci che riducono la contrattilità uterina. Questo metodo utilizza la capacità unica dell’intero tratto riproduttivo del mouse di mostrare motilità spontanea se mantenuto ex vivo in una parabola Petri contenente buffer Krebs ossigenato. Questa motilità spontanea assomiglia all’attività miometria simile all’onda dell’utero umano, indicato come onde endometriali. Per dimostrare l’efficacia del metodo, abbiamo impiegato un noto farmaco rilassante uterino, epinefrina. Dimostriamo che la motilità spontanea dell’intero tratto riproduttivo del topo può essere inibita rapidamente e reversibilmente da 1 epinefrina in questo modello di piatto Petri. Documentare i cambiamenti di motilità uterina può essere facilmente fatto utilizzando un normale smartphone o una sofisticata fotocamera digitale. Abbiamo sviluppato un algoritmo basato su MATLAB che consente al tracciamento del movimento di quantificare i cambiamenti spontanei di motilità uterina misurando la velocità dei movimenti del corno uterino. Uno dei principali vantaggi di questo approccio ex vivo è che il tratto riproduttivo rimane intatto per tutto l’esperimento, preservando tutte le interazioni cellulari intrinseche intrauterine. La limitazione principale di questo approccio è che fino al 10-20% degli uteri non può presentare motilità spontanea. Finora, questo è il primo metodo quantitativo ex vivo per valutare la motilità uterina spontanea in un modello di piatto Petri.

Introduction

Come un importante organo femminile, l’utero è cruciale per la riproduzione ed essenziale per il nutrimento del feto1. L’utero è costituito da tre strati: il perimetrio, miometrio ed endometrio. Il miometrio è il principale strato contrattuale dell’utero e svolge un ruolo chiave nella consegna del feto. L’endometrio è lo strato più interno che riveste la cavità uterina ed è essenziale per l’impianto dell’embrione. Nelle femmine non incinte in età riproduttiva, lo strato endometriale viene versato mensilmente all’inizio del ciclo mestruale. Il miometrio aiuta in questo processo di spargimento mantenendo le contrazioni miometriche spontanee necessarie per eliminare il tessuto endometriale necrotico dall’utero1.

Purtroppo, aumento della contrattilità miometriale può provocare effetti collaterali negativi come dismenorrea, o crampi mestruali dolorosi. Questo è particolarmente visto nelle giovani femmine e nelle donne nullime2. Tuttavia, la dismenorrea è diversa per ogni donna e dipende dalla forza delle loro contrazioni miometriche; contrazioni più forti sono spesso associate alla sensazione di gravi crampi3. La contrattilità miometriale può essere visualizzata utilizzando ultrasuoni uterini ed è spesso riconosciuta come onde endometriali. Maggiore rilascio di prostaglandine durante le mestruazioni4 in un utero sottoposto a sloughing endometriale è creduto per contribuire ad aumento dell’ipercontrattualità miometria, conseguente ischemia e ipossia del muscolo uterino e quindi aumentato dolore3.

Grave dismenorrea può ostacolare l’attività quotidiana di alcune donne e 3 a 33% delle donne hanno dolore molto grave, che potrebbe causare una donna a letto per 1 a 3 giorni ogni ciclo mestruale5. La dismenorrea è la principale causa di morbilità ginecologica nelle donne in età riproduttiva indipendentemente dall’età, dalla nazionalità e dallo status economico5. La prevalenza stimata di dismenorrea è alta e variabile, che va dal 45% al 93% nelle donne di età riproduttiva5.  Il dolore associato alla dismenorrea ha un effetto sulla vita quotidiana delle donne e può provocare scarse prestazioni accademiche negli adolescenti, minore qualità del sonno, restrizione delle attività quotidiane e cambiamenti di umore5.

Molte donne che sperimentano grave dismenorrea ricorrono a farmaci da banco per alleviare il loro dolore. Tali farmaci da banco contengono inibitori cicloossigenasi (COX) che impediscono la formazione di prostaglandine6 . Tuttavia, gli inibitori di COX sono associati a eventi cardiovascolari avversi e circa il 18% delle donne con dismenorrea non risponde a questi inibitori7. Pertanto, vi è la necessità di nuovi farmaci per ridurre i crampi mestruali. Poiché oltre la contrattilità dell’utero contribuisce alla patogenesi della dismenorrea, una possibile strategia può essere l’uso di rilassanti uterini.

È utile quantificare gli effetti di potenziali farmaci rilassanti in un modello di contrazioni miometriche miometriche naturali. Tuttavia, finora, non è stato descritto alcun metodo ex vivo efficiente per testare farmaci che rilassano i muscoli nell’utero intatto. Attualmente, le misurazioni della tensione isometrica vengono utilizzate per valutare gli effetti del farmaco rilassante. Durante tali misurazioni, una striscia muscolare uterina viene mantenuta ad una lunghezza costante sotto precarico in un bagno di tessuto mentre la forza delle contrazioni muscolari uterine viene registrata prima e dopo la stimolazione dell’ossitocina in presenza o assenza di un farmaco rilassante. Anche se questo approccio è molto utile, richiede attrezzature costose. Inoltre, le contrazioni isometriche non assomigliano alle contrazioni spontanee simili all’onda del miometrio che si verificano naturalmente nell’utero intatto. In modo univoco, le onde della miometria uterina nei roditori possono essere visualizzate come motilità del corno uterino quando l’intero tratto riproduttivo (ovaie, ovidotti, utero e vagina) viene mantenuto in una soluzione cuscinetto. Qui, presentiamo un metodo ex vivo per monitorare la motilità spontanea dell’utero murino intatto posto in una piastra Petri contenente buffer Krebs ossigenato. Descriviamo anche un algoritmo di quantificazione della motilità che utilizza il motion tracker MATLAB. Questo nuovo approccio fornisce un’alternativa semplice e meno costosa per testare il potenziale rilassante dei rimedi naturali e dei composti sintetici.

Protocol

Tutte le procedure con animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee presso la Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 mesi-vecchio F2-129S-C57BL/6 topi femminili sessualmente maturi sono stati utilizzati nello studio. ATTENZIONE: Garantisci la sicurezza indossando un camice da laboratorio, una maschera e dei guanti quando lavori con animali e materiali biopericolosi. 1. Preparazione della soluzion…

Representative Results

La figura 1 mostra le immagini rappresentative scattate durante l’intera procedura di isolamento del tratto riproduttivo descritta in questo protocollo. Per evitare di contaminare il buffer con la pelliccia, che diminuirebbe la qualità video, abbiamo inumidito il corpo del topo con il 70% di etanolo. Il principale punto di riferimento per la sezione di dissezione del protocollo è quello di trovare la vescica urinaria. L’utero e la vagina saranno situati inferiori alla vescica urinaria….

Discussion

Qui, abbiamo descritto un metodo per valutare la contrattilità spontanea dell’intero tratto riproduttivo del roditore, che include le ovaie, gli ovidotti, le corna uterine e la vagina. Abbiamo usato un metodo simile per dimostrare l’effetto rilassante della fenilofina sulla motilità uterina spontanea13, tuttavia in passato non siamo stati in grado di fornire un’analisi quantitativa dei dati. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un algoritmo per l’analisi quantitativa dei dati di motilità utiliz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi INTERNI dell’IU. AGO ha concepito lo studio. XC e AGO sono stati coinvolti nella progettazione degli esperimenti descritti.  FL e AGO hanno analizzato e interpretato i dati. KLL, JOB, FL ha eseguito tutti gli esperimenti ex vivo. FL ha scritto lo script MATLAB. KLL, JOB e AGO hanno scritto il manoscritto.  Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale del manoscritto.

Materials

Epinephrine hydrochloride Sigma-Aldrich  E4642 
Dulbecco's PBS Fisher Sceintific  17-512Q
Ethanol 200 PROOF Decon Laboratories 2701
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glucose Sigma-Aldrich G7528
KCl Sigma-Aldrich P9333
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C5080
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
MgCl2  · 6H2O Sigma-Aldrich M9272
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Isoflurane, USP Patterson Veterinary 07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps Fisher Sceintific 13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope Leica MZ6 
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system Leica  DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources Fisher Sceintific  12-562-21
Weigh Boat Fisher Sceintific  WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown  Cardinal Health  9515 Small, Medium or Large
Gloves McKesson Corporation 20-1080 Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
 Petri Dish Corning Falcon 351029 100 mm
 Petri Dish Corning Falcon 353001 35 mm
95% O2– 5% CO2 gas mixture Praxair  MM OXCD5-K
Ear-loop Masks Valumax International 5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera Canon EOS Rebel T6i
MATLAB MathWorks N/A version 2019 or later

References

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Cite This Article
Liang, K. L., Bursova, J. O., Lam, F., Chen, X., Obukhov, A. G. Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis. J. Vis. Exp. (151), e59848, doi:10.3791/59848 (2019).

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