Ex vivo-methode voor het beoordelen van het voortplantingsstelsel van muizen spontane beweeglijkheid en een op MATLAB gebaseerd baarmoeder bewegings Volgalgoritme voor gegevensanalyse

Summary

Baarmoeder contracties zijn belangrijk voor het welzijn van vrouwen. Echter, pathologisch verhoogde contractiliteit kan leiden tot dysmenorroe, vooral bij jongere vrouwtjes. Hier beschrijven we een eenvoudige ex vivo voorbereiding waardoor een snelle beoordeling van de werkzaamheid van glad Spierrelaxantia die kunnen worden gebruikt voor de behandeling van dysmenorroe.

Abstract

Dysmenorroe, of pijnlijke krampen, is het meest voorkomende symptoom geassocieerd met menstruatie bij vrouwtjes en de ernst ervan kan het dagelijks leven van vrouwen belemmeren. Hier presenteren we een eenvoudige en goedkope methode die instrumentaal zou zijn voor het testen van nieuwe medicijnen die de contractiliteit van de baarmoeder verminderen. Deze methode maakt gebruik van het unieke vermogen van het hele muis voortplantingsstelsel om spontane beweeglijkheid te vertonen bij het onderhouden van ex vivo in een Petri schaaltje met zuurstofhoudende Krebs-buffer. Deze spontane beweeglijkheid lijkt op de golfachtige myometriale activiteit van de menselijke baarmoeder, aangeduid als endometriale golven. Om de effectiviteit van de methode te demonstreren, we werkten een bekende baarmoeder spierverslapper drug, adrenaline. We tonen aan dat de spontane beweeglijkheid van het hele muis voortplantingskanaal snel en omkeerbaar kan worden geremd door 1 μM epinefrine in dit Petri schaalmodel. Het documenteren van de veranderingen van de beweeglijkheid van de baarmoeder kan gemakkelijk worden gedaan met behulp van een gewone smartphone of een geavanceerde digitale camera. We ontwikkelden een op MATLAB gebaseerd algoritme dat bewegingsregistratie mogelijk maakt om spontane baarmoeder motiliteits veranderingen te kwantificeren door de snelheid van baarmoeder hoorn bewegingen te meten. Een groot voordeel van deze ex vivo-benadering is dat het voortplantingskanaal gedurende het hele experiment intact blijft, met behoud van alle intrinsieke intra-uteriene cellulaire interacties. De belangrijkste beperking van deze aanpak is dat tot 10-20% van de uteri geen spontane beweeglijkheid kan vertonen. Tot nu toe is dit de eerste kwantitatieve ex vivo -methode voor het beoordelen van de spontane baarmoeder beweeglijkheid in een Petri schaalmodel.

Introduction

Als een groot vrouwelijk orgaan is de baarmoeder cruciaal voor de voortplanting en essentieel voor de voeding van de foetus¹. De baarmoeder bestaat uit drie lagen: het perimetrium, myometrium en endometrium. Het myometrium is de belangrijkste contractiele laag van de baarmoeder en speelt een sleutelrol bij de levering van foetus. Het endometrium is de binnenste laag die de baarmoederholte binnenvalt en is essentieel voor de implantatie van embryo’s. Bij niet-zwangere vrouwen in de reproductieve leeftijd wordt de endometrium laag maandelijks vergoten aan het begin van de menstruatiecyclus. Het myometrium helpt bij dit afslijmingsproces door de spontane myometriale contracties te handhaven die nodig zijn voor het verwijderen van het necrotische baarmoederslijmvlies van de baarmoeder¹.

Helaas, verhoogde myometriale contractiliteit kan resulteren in negatieve bijwerkingen zoals dysmenorroe, of pijnlijke menstruele krampen. Dit is vooral te zien bij jonge vrouwtjes en nullipareuze vrouwen². Echter, dysmenorroe is verschillend voor elke vrouw en hangt af van de sterkte van hun myometriale contracties; sterkere contracties worden vaak geassocieerd met het gevoel van ernstige kramp³. Myometriale contractiliteit kan worden gevisualiseerd met behulp van baarmoeder echografie en wordt vaak herkend als endometriale golven. Verbeterde afgifte van prostaglandinen tijdens de menstruatie⁴ in een baarmoeder die endometrium verjering ondergaat, wordt verondersteld om bij te dragen aan verhoogde myometriale hypercontractiliteit, resulterend in ischemie en hypoxie van de baarmoeder spier en aldus verhoogd pijn³.

Ernstige dysmenorroe kan belemmeren de dagelijkse activiteit van sommige vrouwen en 3 aan 33% van de vrouwen hebben zeer ernstige pijn, die kan leiden tot een vrouw te bedlegerig voor 1 aan 3 dagen elke menstruele cyclus⁵. Dysmenorroe is de belangrijkste oorzaak van gynaecologische morbiditeit bij vrouwen in de reproductieve leeftijd ongeacht leeftijd, nationaliteit, en economische status⁵. De geschatte prevalentie van dysmenorroe is zowel hoog als variabel, variërend van 45% tot 93% bij vrouwen in de reproductieve leeftijd⁵.  Dysmenorroe-geassocieerde pijn heeft een effect op het dagelijks leven van vrouwen en kan resulteren in slechte academische prestaties bij adolescenten, lagere kwaliteit van de slaap, beperking van de dagelijkse activiteiten, en stemmingswisselingen⁵.

Veel vrouwen die ervaren ernstige dysmenorroe Resort om over-the-counter medicatie om hun pijn te verlichten. Dergelijke over-the-counter medicatie bevatten cyclooxygenase (COX) remmers die de vorming van prostaglandinen⁶voorkomen. Echter, COX-remmers worden geassocieerd met ongewenste cardiovasculaire voorvallen, en ongeveer 18% van vrouwen met dysmenorroe zijn niet reageren op deze remmers⁷. Daarom is er behoefte aan nieuwe medicijnen om menstruele krampen te verminderen. Aangezien over contractiliteit van de baarmoeder bijdraagt aan de pathogenese van dysmenorroe, kan een mogelijke strategie het gebruik van uteriene relaxants zijn.

Het is gunstig om de effecten van potentiële spierverslapper drugs te kwantificeren in een model van natuurlijk voorkomende spontane myometriale golf-achtige contracties. Tot dusver is echter geen efficiënte ex vivo-methode voor het testen van spier-ontspannende geneesmiddelen in de intacte baarmoeder beschreven. Op dit moment, isometrische spanning metingen worden gebruikt voor het evalueren van spierverslapper drug effecten. Tijdens dergelijke metingen, een baarmoeder spier strip wordt gehandhaafd op een constante lengte onder voorladen in een weefsel Bad terwijl de kracht van baarmoeder spiercontracties wordt geregistreerd voor en na oxytocine stimulatie in de aanwezigheid of afwezigheid van een spierverslapper drug. Hoewel deze aanpak is zeer nuttig, het vereist dure apparatuur. Bovendien lijken isometrische contracties niet op de spontane myometriale golfachtige contracties die van nature voorkomen in de intacte baarmoeder. Op unieke wijze kunnen de uteriene myometriale golven bij knaagdieren worden gevisualiseerd als de beweeglijkheid van de baarmoeder hoorn wanneer het gehele voortplantingskanaal (eierstokken, baarmoeder en vagina) in een bufferoplossing wordt gehandhaafd. Hier presenteren we een ex vivo-methode voor het monitoren van de spontane beweeglijkheid van de intacte muis baarmoeder geplaatst in een Petri schaaltje met een zuurstof buffer. We beschrijven ook een motiliteits kwantificerings algoritme met behulp van de MATLAB Motion tracker. Deze nieuwe aanpak biedt een eenvoudig en goedkoper alternatief voor het testen van het spierverslapper potentieel van natuurlijk voorkomende remedies en synthetische verbindingen.

Protocol

Alle procedures met dieren zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité aan de Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 maand-oude F2-129S-C57BL/6 seksueel volwassen vrouwelijke muizen werden gebruikt in de studie. Let op: Zorg voor veiligheid door het dragen van een Labcoat, masker en handschoenen bij het werken met dieren en biogevaarlijke materialen. 1. voorbereiding van de oplossing Berei…

Representative Results

Figuur 1 toont representatieve beelden die zijn genomen tijdens de gehele isolatie procedure voor het voortplantingsstelsel die in dit protocol wordt beschreven. Om besmetting van de buffer met bont, die de videokwaliteit zou afnemen, te voorkomen, bevochtigd we het muis lichaam met 70% ethanol. De belangrijkste benchmark voor het dissectie gedeelte van het protocol is het vinden van de urineblaas. De baarmoeder en de vagina zullen lager liggen dan de urineblaas. …

Discussion

Hier beschrijven we een methode voor het beoordelen van de spontane contractiliteit van het gehele voortplantingsstelsel van knaagdieren, dat de eierstokken, oviducts, baarmoeder hoorns en de vagina omvat. We gebruikten een soortgelijke methode om aan te tonen van de spierverslapper effect van fenylefrine op spontane uteriene motiliteit¹³, echter, in het verleden waren we niet in staat om kwantitatieve analyse van de gegevens te verstrekken. In dit werk ontwikkelden we een algoritme voor kwantitat…

Materials

Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Small, Medium or Large
Gloves	McKesson Corporation	20-1080	Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2– 5% CO2 gas mixture	Praxair	MM OXCD5-K
Ear-loop Masks	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	version 2019 or later