Fine Needle Aspiration – это метод, при котором клетки получаются из поражения или органа с помощью тонкой иглы. Аспирированный материал смазывается, окрашивается и исследуется под микроскопом для диагностики или используется для молекулярной биологии, цитометрии или анализа пробирки. Это дешево, просто, быстро и вызывает минимальную травму.
Fine Needle Aspiration (FNA) является обычной диагностической процедурой, необходимой как для медицинской, так и для ветеринарной практики. Она состоит из перкутанного аспирации клеток и/или микроорганизмов из ощутимых масс, органов или выпотов (накопление жидкости в полости тела) с помощью тонкой иглы, похожей на обычную иглу, используемую для венозного прокола. Материал, собранный FNA, в целом высококлеточный, и извлеченный аспират затем смазывается, сушат воздух, мокрые фикчированные, окрашенные и наблюдается под микроскопом. В клиническом контексте, FNA является важным диагностическим инструментом, который служит в качестве руководства для соответствующего терапевтического управления. Поскольку он прост, быстр, малоинвазивн и требует ограниченных инвестиций в лабораторные и людские ресурсы, он широко используется ветеринарными специалистами, в основном в домашних, но и в сельскохозяйственных животных. В исследованиях с использованием моделей животных, FNA имеет то преимущество, что она может быть выполнена неоднократно в том же животном, что позволяет продольных исследований через сбор клеток из опухолей и органов / тканей в течение болезни. В дополнение к обычной микроскопии, извлеченный материал также может быть использован для иммуноцитохимии, электронной микроскопии, биохимического анализа, цитометрии потока, молекулярной биологии или in vitro assays. FNA был использован для выявления простейшей паразит trypanosoma brucei в гонады инфицированных мышей, открывая возможность для будущего диагноза у крупного рогатого скота.
Fine Needle Aspiration (FNA) широко используется в диагностике онкологических и неопластических заболеваний, как у животных, так и у домашних животных. Техника была стандартизирована на протяжении многих лет и описана в многочисленных учебниках1,2.
Она в значительной степени состоит из перкутанного стремления ощутимых масс, органов или выпотов с тонкой иглой, установленной на пустой шприц, используя отрицательное давление, чтобы вывести клетки или жидкость из массы1,3. Иглы, как правило, от 22 до 25 G (калибровка, соответствующая иглы внутреннего диаметра), и использование больших иглы (большой диаметр, например, 21 G) полезно для увеличения клеточной, хотя это может привести к чрезмерному загрязнению крови. Длина иглы будет зависеть от глубины массы, но 1 или 11’2 дюйма обычно используется для поверхностных масс. Шприцы, как правило, от 5 до 10 мл, с большими шприцев достижения более высокого вакуума, который, в свою очередь, увеличивает выход аспирата. Не-ощутимые глубоко сидячие массы также могут быть аспирированы, с более длинными иглами и под руководством изображения (ультрасонография). Извлеченный аспират может быть смазан, высушен воздухом, мокрой фиксированной, окрашенных и наблюдается под микроскопом для достижения диагноза3 (Рисунок 1).
Это простая, недорогая, безболезнененная и минимально инвазивная техника, в основном используемая в предоперационной обстановке для достижения диагноза на ощутимых массах, а также для органов, таких как лимфатические узлы, щитовидная железа, простата или даже внешние мужские репродуктивные структуры 1. В дополнение к тому, диагностический инструмент, этот метод может быть использован для сбора клеток для других целей, а именно, цитогенетика, электронная микроскопия (Рисунок 1D), поток цитометрической характеристики4,5 ,6,7, создание клеточных культур8. Распространенным примером в клинической практике является поиск спермыдля экстракорпорального оплодотворения 9.
Стремление может быть повторено несколько раз в той же массе, чтобы получить несколько мазков. В случае разнородного поражения, например, твердой области и кистозного пространства, важно, чтобы клетки аспирировались из каждого региона. Материал, собранный ФНА, в целом высококлеточный, что в большинстве случаев позволяет диагностировать заболевания без необходимости биопсии тканей. Специальные пятна, иммунофлуоресценция. иммуноцитохимия(рисунок 1D),и молекулярные методы также могут быть выполнены в мазках, полученных через FNA, например, для идентификации инфекционных агентов, когда не узнаваемы ежей только по морфологии10. Краткий обзор общих заявок и оборудования и материалов, необходимых для ФНА, обобщен в таблицах 1 и 2,соответственно.
Первый доклад об использовании прокола иглы для диагностических целей описан в ранних писаниях арабской медицины, но это в начале 20-го века, что современные методы аспирации иглы были реализованы11. Примечательно, что, возможно, первый доклад, который предлагает использование FNA для диагностики инфекционных заболеваний было исследование в 1904 году, где Григ и Грей сообщили иглы стремления лимфатических узлов от пациентов со сонной болезнью показали мотилические trypanosomes12 . Авторы сообщили о наличии трипаносомы как в ранних, так и в запущенных случаях, причем при более высокой плотности, чем в мазках крови, где это часто редкие события12.
Текущий диагноз трипаносомоза у крупного рогатого скота опирается на прямое наблюдение паразитов в крови, лимфатической или иммунодиагностической технике13,14,15. Мы ранее показали, что в экспериментальных инфекций трипаносомы у мыши, Trypanosoma brucei (T. brucei) имеет замечательный тропизм жировой ткани16, а также некоторые внешние мужские репродуктивные структуры, а именно эпидидимис17. Паразиты накапливаются в строми этих тканей в большом количестве16.
Протокол, изображенный ниже, описывает подробную пошаговую техническую процедуру для FNA у живых мышей, направленную на стремление трипаносом, присутствующих во внешних мужских репродуктивных структурах (testis, epididymis и эпидидимальных жира), а затем традиционная цитология и иммуностоинг для специфических белков паразитов (VSG)16,17. Стремление было выполнено через 6 дней после инфекции и процедуры безопасности, которые применяются те, обычно установленных для регулярного обращения с экспериментальными животными. Дополнительные меры необходимы для животных, которые имеют иммунный дефицит (ношение паростерилизовательное платье, маска, капот для волос, стерильные перчатки, и обеспечение асептической техники во все времена), чтобы смягчить случайное воздействие оппортунистических патогенов.
Fine Needle Aspiration (FNA) является методом, широко используемым для диагностики заболеваний у человека и домашних животных. Техника была стандартизирована на протяжении многих лет1,2, который использует мелкой иглы, чтобы аспирировать клетки или жидкость из ощутимой массы или органа1,3. Аспират затем, как правило, смазывают на стеклянной горке и окрашенных для микроскопического наблюдения для достижения диагноза, но техника также может быть использован аспиратом для других целей4,5,6, 7 (г. , 8 , 9.
Процедура быстрая (для опытного исследователя 5 мин на мышь) и риск осложнений минимален, по аналогии с риском, понесенным при прохождении простого венозного прокола. По этой причине, для FNA ощутимых масс, анестезия требуется только для чувствительных анатомических местах или когда хорошая иммобилизация животного и стабилизации органа или массы, чтобы быть аспирированным чрезвычайно важно для оптимальных результатов. Это часто для мелких лабораторных животных, как безопасное и эффективное ограничение небольшого грызуна с одной стороны, обеспечивая лучший доступ к области для устремления с другой стороны, трудно достичь без анестезии. Краткосрочная анестезия в большинстве случаев достаточна, тем не менее необходима, для хорошего FNA в мыши. Хорошая иммобилизация максимизирует шансы получения аспирата, который является репрезентативным для клеточных компонентов поражения, а также сводит к минимуму шансы на экстернализацию кончика иглы при применении отрицательного давления.
Хотя сама процедура очень проста, скоординированное применение и высвобождение вакуума являются наиболее важными шагами. После вставки иглы, поршень шприца убирается для достижения контролируемого вакуума (всасывания), и игла может быть удалена из массы только после освобождения отрицательное давление, отпустив поршень (Рисунок 2); в противном случае аспират всасывается в бочку шприца, а затем очень трудно восстановить. Еще одним очень важным шагом является подготовка высококачественных мазков. Существуют различные методы, чтобы сделать мазок, но независимо от метода, мазки должны быть подготовлены сразу же после того, материал был помещен на стекло. Биологический материал должен быть распространен осторожно, чтобы избежать клеточной дробления артефактов. Использование coverslip в качестве распределители может помочь предотвратить эти артефакты. Тем не менее, применение слишком много силы при принятии мазок сломает coverslip. Мазок хорошего качества обычно имеет большую часть популяции клеток, распределенных как монослой, так что они могут легко передавать свет. Сотовый материал не должен быть чрезмерно в ловушке в сгусток крови.
Целью FNA является сбор клеток из массы, ткани или органа. Использование больших игл ы полезны для увеличения клеточной, но может быть связано с чрезмерным загрязнением крови, в то время как выборка с меньшими иглами дает более высокое качество, хотя и менее обильный материал. В нашем случае, перкутанное стремление внешних мужских репродуктивных структур у мышей, экспериментально инфицированных T. brucei, было выполнено с 22-калиберными иглами в сочетании с 5 мл шприца. Мыши были под анестетом, яички стабилизировались одной рукой и проколить и стремление руководствоваться и выполняется с другой стороны. Мы извлекли многочисленные трипаносомы, смешанные с зародышевыми клетками, сперматозоидами, сперматозоидами, эпителиальными клетками и стромальными клетками, которые были смазаны и ослаблены на поверхностные белки паразитов (VSG) (Рисунок 4).
Существует всегда потенциальная ошибка выборки в аспирати дает отрицательные результаты, потому что, хотя несколько областей данного поражения могут быть отобраны несколько раз, это слепое стремление, где мы не визуализировать кончик иглы и целевой орган или массу. Это крайне актуально в клинических условиях, где негативное FNA подозрительного поражения не отменяет дальнейших исследований, но это не так актуально в животных моделях болезни. Таким образом, общие ограничения включают в основном ложные отрицательные результаты и реже ложные положительные результаты (например, от загрязнения крови), но наиболее важным ограничением в настройках экспериментов на животных является отсутствие информации о тканях архитектура17, как у нас с гистопатологией, например, распределение картины паразитов, иммунных клеток, и клеточных взаимодействий особенностей. Тем не менее, преимущества в том, что FNA является нетерминальной процедурой, позволяющей проводить повторный отбор проб в одном и том же животном, и всегда позволяет лучше сохранившуюся клеточную морфологию(рисунок 5). Альтернативы FNA для сбора клеток-хозяев, иммунных клеток или микроорганизмов от мыши всегда полагаются на эвтаназию мыши для сбора массы или органов, представляющих интерес.
Насколько нам известно, Есть только несколько докладов об использовании FNA в небольших лабораторных животных, один из 1949, соответствующие стремление костного мозга с 22 G иглы для изучения hematopoiesis18, и все другие в сочетании с потоком цитометрии количественно либо опухолевых воспалительных клеток или эндотелиальных клеток7,19,20. Наша работа показывает, что этот метод может быть распространен на диагностику и изучение моделей инфекционных заболеваний и может сочетать цитологию с такими методами, как иммуноцитохимия или электронная микроскопия. Два основных преимущества метода у экспериментальных животных: (1) эта процедура не является терминальной, т.е. может быть выполнена у живых мышей; и (2) из-за своей легкой тяжести он позволяет для серийных устремлений в том же животном. Таким образом, меньше мышей требуется для каждого исследования, и корреляция между прогрессированием клинических заболеваний и эволюции клеточных и молекулярных особенностей болезни и / или микроорганизмов может быть легко выполнена, что позволяет продольных исследований.
Возможно, первый доклад об использовании FNA для диагностики инфекционных заболеваний является исследование Григ и Грей в 1904 году, что доклады иглы стремления лимфатических узлов от пациентов со сонной болезнью, которая показала, мотилические trypanosomes12. Если наши выводы на лабораторных мышах найдут перевод на крупный рогатый скот, т.е. если трипаносома может быть легко отобрана ФНА из внешних мужских репродуктивных структур, можно ожидать, что этот метод будет полезен ветеринарам для диагностики животных трипаносомоз на ферме, в животноводстве.
The authors have nothing to disclose.
Этот проект был профинансирован Фондом пара Ci’ncia e Tecnologia (FCT)/ Министерио да Сьенсия, Tecnologia электронной Ensino Superior (MCTES) через Fundos ду Оршаменто де Эстадо (реф.: ID / BIM/50005/2019). LMF является исследователем Фонда пара Ci’ncia электронной Tecnologia (IF/01050/2014) и лаборатория финансируется ERC (FatTryp, ref.771714). Публикация этой работы также финансировалась UID/BIM/50005/2019 проект, финансируемый Funda’o para a Ci’ncia e a Tecnologia (FCT)/ Министерио да Сьенсия, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) через Fundos do Or’amento de Estado. Мы благодарим Андрея Пинто из Лаборатории гистологии и сравнительной патологии ИММ за помощь эксперта по электронной микроскопии, а Сандру Триндаде, Тиаго Ребело и Энрике Мачадо (iMM) за обмен тканями инфицированных мышей.
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |