미세 한 바늘 흡인 은 얇은 바늘을 사용하여 병변 이나 장기에서 세포를 수득 하는 기술이다. 흡인 물질은 진단을 위해 현미경으로 얼룩지고, 염색되고 검사되거나 분자 생물학, 세포 분석 또는 시험관 내 분석에 사용됩니다. 그것은 저렴하고 간단하며 빠르며 최소한의 외상을 일으킵니다.
정밀 한 바늘 흡인 (FNA) 의료 및 수의학 관행모두에 필수적인 일상적인 진단 절차. 그것은 정맥 천자에 사용되는 일반 바늘과 유사한 얇은 바늘을 사용하여 만져 볼 수있는 덩어리, 장기 또는 삼출물 (체내에 유체 축적)에서 세포 및 / 또는 미생물의 경피적 인 흡인으로 구성됩니다. FNA에 의해 수집된 물질은 일반적으로 고도로 세포적이며, 회수된 흡인은 다음 번지, 공기 건조, 젖은 고정, 염색 및 현미경하에서 관찰된다. 임상 맥락에서, FNA는 적절한 치료 관리에 대한 가이드 역할을하는 중요한 진단 도구입니다. 그것은 간단 하기 때문에, 빠른, 최소 침습 하 고 실험실 및 인적 자원에 제한 된 투자를 필요 하기 때문에, 그것은 광범위 하 게 수의학 실무자에 의해 사용, 주로 국내에서, 뿐만 아니라 농장 동물에서. 동물 모델을 사용 하 여 연구에서, FNA는 동일한 동물에서 반복적으로 수행 될 수 있는 장점이 있다, 질병의 과정을 통해 종양및 장기/조직에서 세포의 수집을 통해 세로 연구를 가능하게. 일상적인 현미경 검사법 이외에, 검색된 물자는 또한 면역 세포화학, 전자 현미경 검사법, 생화확적인 분석, 유세포 분석, 분자 생물학 또는 시험관외 분석학을 위해 이용될 수 있습니다. FNA는 감염된 마우스의 생식선에서 원생 동물 기생충 Trypanosoma brucei를 확인하는 데 사용되어, 가축의 미래 진단을위한 가능성을 열어.
미세 바늘 흡인 (FNA)은 인간과 가축 모두에서 암 및 비 신생물 질환의 진단에 널리 사용됩니다. 이 기술은 수년에 걸쳐 표준화되었으며 수많은 교과서1,2에설명되어 있습니다.
그것은 주로 빈 주사기에 장착 된 얇은 바늘을 가진 만져볼 수있는 덩어리, 기관 또는 삼출액의 경피적 인 포부로구성되며, 음의 압력을 사용하여 질량 1,3에서세포 또는 유체를 철회합니다. 바늘은 전형적으로 22 내지 25 G (바늘 내경에 대응하는 게이지) 및 더 큰 보어 바늘의 사용 (큰 직경, 예를 들어, 21 G)은 과도한 혈액 오염을 생성할 수 있지만, 세포성을 증가시키는 데 도움이된다. 바늘 길이는 질량의 깊이에 따라 달라지지만 1 또는 11/2 인치는 일반적으로 표면 질량에 사용됩니다. 주사기는 일반적으로 5 ~ 10 mL이며, 더 큰 주사기는 더 높은 진공을 달성하여 흡인 수율을 증가시킵니다. 만져도 볼 수 없는 깊은 질량은 더 긴 바늘과 이미지 안내(초음파)로 흡인할 수도 있습니다. 회수된 흡아는 다음 번질, 공기 건조, 젖은 고정, 염색 및 진단을 달성하기 위해 현미경하에서 관찰될 수 있다 3(도 1).
이것은 간단하고 저렴하며 통증이 없고 최소 침습적 인 기술로 수술 전 설정에서 주로 만져 볼 수있는 질량과 림프절, 갑상선, 전립선 또는 외부 남성 생식 구조와 같은 장기에 대한 진단을 달성하는 데 사용됩니다. 1. 진단 도구 이외에,이 기술은 세포 유전학, 전자 현미경 검사법 (그림1D),유동 세포 측정 특성화 4,5 와 같은 다른 목적으로 세포의 수집에 사용할 수 있습니다. ,6,7, 세포 배양 의 설립8. 임상 사례에서 일반적인 예는 체외 수정에 대한정자 검색 9.
흡인은 여러 번 얼룩을 얻기 위해 동일한 질량에서 여러 번 반복 될 수 있습니다. 이질성 병변의 경우, 예를 들어, 고체 영역 및 낭포 공간, 세포가 각 영역에서 흡인되는 것이 중요하다. FNA에 의해 수집 된 물질은 일반적으로 매우 세포적이며, 대부분의 경우 조직 생검없이 질병의 진단을 허용합니다. 특수 얼룩, 면역 형광. 면역세포화학(도1D)및 분자 기술은 또한 FNA를 통해 수득된 얼룩에서 수행될 수 있으며, 예를 들어, 형태론으로만 인식할 수 없을 때 감염제의 식별을위해 10. 일반 응용 프로그램 및 FNA에 필요한 장비 및 소모품에 대한 간략한 개요는 각각 표 1과 2에요약되어 있습니다.
진단 목적을 위한 바늘 구멍의 사용에 대한 첫번째 보고는 아랍 의학의 초기 저술에서 기술됩니다, 그러나 현대 바늘 포부 기술이11를실행되었다는 것은 20 세기 초에 입니다. 특히, 아마도 전염병의 진단을 위한 FNA의 사용을 건의하는 첫번째 보고는 1904년에 연구 결과이었습니다, Grieg와 회색은 수면 병을 가진 환자에게서 림프절의 바늘 포부를 보고한 곳에 12 motile trypanosomes를 제시했습니다12 . 저자는 초기와 고급 케이스 둘 다에 있는 trypanosomes의 존재를 보고하고, 이들은 수시로 희소한 사건12인혈액 얼룩에서 보인 보다는 더 높은 조밀도에서.
가축의 Trypanosomiasis의 현재 진단은 혈액, 림프 또는 면역 진단 기술13,14,15에서기생충의 직접적인 관찰에 의존한다. 우리는 이전에 마우스에 있는 실험적인 Trypanosoma 감염에서, Trypanosoma brucei (T.brucei)는지방 조직(16)에 또한 외부 남성 생식 구조물의 일부에 현저한 tropism가 있다는 것을 보여주었습니다, 즉 부고환17. 기생충은 많은 수의 이 조직의 기질에축적16.
아래에 묘사 된 프로토콜은 외부 남성 생식 구조 (고환, 부고환및 부고환 지방)에 존재하는 trypanosomes의 열망을 목표로 살아있는 마우스에서 FNA에 대한 상세한 단계별 기술 절차를 설명합니다. 특정 기생충 단백질 (VSG)16,17에대한 기존의 세포학 및 면역 염색. 포부는 실험동물의 일상적인 취급을 위해 일반적으로 확립된 감염 및 안전 절차 후 6일 후에 수행되었다. 면역 결핍증이 있는 동물(증기 살균 가운, 마스크, 헤어 보닛, 멸균 장갑 착용, 항상 무균 기술 보장)이 있는 동물은 기회병원균에 우발적으로 노출되는 것을 완화하기 위한 추가적인 조치가 필요합니다.
미세 바늘 흡인 (FNA)은 인간 및 가축의 질병을 진단하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 이 기술은 수년 동안 표준화되어1,2,이는 만져 볼 수있는 질량 또는 기관1,3에서세포 또는 유체를 흡인하기 위해 작은 보어 바늘을 사용합니다. 흡아는 일반적으로 유리 슬라이드에 얼룩지고 진단을 달성하기 위해 현미경 관찰을 위해 염색되지만, 기술은 다른 목적으로 세포를 검색하는데 사용할 수도 있습니다 4,5,6, 7명 , 8개 , 9.
절차는 빠르다 (<5 마우스 당 분, 숙련 된 연구자에 대 한) 합병증의 위험은 최소한의, 간단한 정 맥 천 자 를 겪고 때 발생 하는 위험과 비슷합니다. 이러한 이유로, 만져볼 수 있는 질량의 FNA의 경우, 마취는 민감한 해부학 적 위치에 만 필요하거나 동물의 좋은 고정과 기관 이나 질량의 안정화가 최적의 결과를 위해 매우 중요합니다. 이것은 작은 실험실 동물에 대 한 자주, 다른 손으로 포부를 위한 지역에 대 한 최상의 액세스를 보장 하는 동안 한 손으로 작은 설치류의 안전 하 고 효과적인 구속으로, 마 취 없이 달성 하기 어렵다. 단기 마취는 마우스에 있는 좋은 FNA를 위해, 그럼에도 불구하고, 대부분의 경우에 충분합니다, 그럼에도 불구하고 필요합니다. 좋은 고정화는 병변의 세포 성분을 대표하는 흡인을 얻을 수있는 기회를 극대화하고 음압이 가해지는 동안 바늘 끝을 외부화 할 가능성을 최소화합니다.
절차 자체는 매우 간단하지만, 조정 된 응용 프로그램 및 진공의 방출은 가장 중요한 단계입니다. 바늘을 삽입한 후, 주사기의 플런저는 제어된 진공(흡입)을 달성하기 위해 후퇴되고, 바늘은 플런저를 놓아 음압을 방출한 후에만질량으로부터 제거될 수 있다(도 2); 그렇지 않으면 흡인은 주사기의 배럴로 빨려 들어간 다음 복구하기가 매우 어렵습니다. 또 다른 매우 중요한 단계는 고품질 얼룩의 준비입니다. 얼룩을 만드는 다양한 방법이 있지만 방법에 관계없이 재료가 유리에 배치 된 직후에 얼룩을 준비해야합니다. 생물학적 물질은 세포 분쇄 유물을 피하기 위해 부드럽게 퍼져야합니다. 커버슬립을 스프레더로 사용하면 이러한 아티팩트를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 얼룩을 만드는 동안 너무 많은 힘의 적용은 커버 슬립을 깰 것입니다. 좋은 품질의 얼룩은 일반적으로 빛을 쉽게 전달할 수 있도록 대부분의 세포 집단이 단층으로 분포되어 있습니다. 세포 물질은 혈전에 과도하게 갇혀서는 안됩니다.
FNA의 목표는 질량, 조직 또는 기관에서 세포를 수집하는 것입니다. 더 큰 보어 바늘의 사용은 셀룰러를 증가시키는 데 도움이되지만, 작은 바늘로 샘플링하는 동안 과도한 혈액 오염과 연관 될 수 있지만 적은 풍부한 물질을 생산합니다. 우리의 경우, T. brucei에실험적으로 감염된 마우스에서 외부 남성 생식 구조의 경피적 흡인은 5 mL 주사기에 결합된 22 게이지 바늘로 수행하였다. 마우스를 마취시키고, 한 손으로 고환을 안정화시키고, 천공 및 흡인을 유도하고, 다른 손으로 수행하였다. 우리는 세균 세포, 정자, 상피 세포 및 기질 세포와 혼합 된 수많은 trypanosomes를 검색, 이는 기생충의 표면 단백질에 대한 번짐 및면역 염색했다 (VSG) (그림 4).
주어진 병변의 여러 영역이 여러 번 샘플링 될 수 있지만, 이것은 우리가 바늘 팁과 대상 기관 또는 질량을 시각화하지 않는 맹목적인 포부이기 때문에 흡인에 항상 부정적인 결과를 산출하는 잠재적 인 샘플링 오차가 있습니다. 이것은 의심스러운 병변의 부정적인 FNA가 추가 조사를 없애지 않는 임상 환경에서 매우 관련이 있지만 질병의 동물 모델에서는 그다지 관련이 없습니다. 따라서, 일반적인 한계는 주로 거짓 음성 결과를 포함하고, 덜 자주 거짓 양성 결과 (예를 들어, 혈액 오염에서), 그러나 동물 실험의 설정에 가장 중요한 제한은 조직에 대한 정보의 부족이다 아키텍처17,우리는 조직 병리학, 예를 들어 기생충의 분포 패턴, 면역 세포, 및 세포 상호 작용 특징과 같이. 그럼에도 불구하고, 장점은 FNA가 동일한 동물에서 반복 샘플링을 허용하는 비말단 절차이며 항상 더 잘보존된 세포 형태를 허용한다는 것이다(도 5). 마우스로부터 숙주 세포, 면역 세포 또는 미생물을 수확하기 위한 FNA에 대한 대안은 항상 마우스를 안락사시켜 관심 있는 덩어리 또는 장기를 수집한다.
우리의 지식에, 작은 실험실 동물에 FNA의 사용에 대 한 몇 가지 보고서가 있다, 1949 에서 하나 와 골수의 포부에 대응 22 조혈을 공부 하기 위한 G 바늘18,그리고 다른 모든 유세포 분석과 함께 종양 관련 염증 세포 또는 내피 세포를 정량화7,19,20. 우리의 일은 이 기술이 감염성 질병 모형의 진단 그리고 연구 결과로 확장될 수 있고 면역 세포화학 또는 전자 현미경 검사법과 같은 기술과 세포학을 결합할 수 있다는 것을 보여줍니다. 실험 동물에서 방법의 주요 장점 중 두 가지는 다음과 같습니다: (1) 이 절차는 말단이 아니며, 즉, 살아있는 마우스에서 수행될 수 있다; (2) 온화한 심각도 때문에 동일한 동물의 연쇄 포부를 허용합니다. 따라서 각 연구에 필요한 마우스 수가 적고, 임상 질환의 진행과 질병 및/또는 미생물의 세포 및 분자 특징의 진화 사이의 상관 관계가 쉽게 수행될 수 있으므로 세로 연구를 가능하게 합니다.
아마도 전염병 진단을 위한 FNA의 사용에 대한 첫 번째 보고서는 1904년에 Grieg와 Gray가 수면 중 질병을 앓고 있는 환자로부터 림프절의 바늘포부를 보고한 연구이며, 이는 12개의 변성 trypanosomes를 밝혀냈습니다. 실험실 마우스에 있는 우리의 사실 인정은 가축에 번역을 찾아내는 경우에, 즉, Trypanosoma가 외부 남성 생식 구조물에서 FNA에 의해 쉽게 샘플링될 수 있는 경우에, 하나는 이 기술이 동물 진단을 위한 수의사에게 유용할 것이라는 점을 기대할 수 있습니다 농장에서 trypanosomiasis, 가축에.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 Fundação 파라 에 의해 투자되었다 Ciência e Tecnologia (FCT)/ 미니스테리오 다 시에엔시아, 테크놀로지아 e 엔시노 슈페리어 (MCTES) Fundos do Orçamento 드 에스타도를 통해 (참조.: ID/ BIM/50005/2019). LMF는 Fundação 파라 Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014)의 조사관이며, 실험실은 ERC (FatTryp, ref.771714)에 의해 투자됩니다. 이 작품의 출판은 또한 Fundação 파라 에 의해 투자 UID / BIM / 50005 / 2019 프로젝트는 Tecnologia (FCT)/ 미니스테리오 다 시에엔시아, Tecnologia e 엔시노 슈페리어 (MCTES) Fundos do Orçamento de Estado를 통해. 우리는 전문가 전자 현미경 지원을 위한 iMM의 조직학 및 비교 병리학 실험실에서 안드레이아 핀토, 및 산드라 Trindade, 티아고 Rebelo 및 헨리크 마차도 (iMM)에 감염된 마우스에서 조직을 공유하기위한 감사합니다.
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |