dsDNAインターカリング色素を用いてこのリアルタイムRT-PCRは、リサウイルス感染の診断に適しています。この方法は、狂犬病から抽出されたRNAから始まり、マンテモーテムまたは死後サンプル、マスターミックス調製、RNA添加、リアルタイムマシンのセットアップ、結果の正しい解釈を詳細に説明します。
分子アッセイは、迅速で感受性が高く、特異的であり、狂犬病の診断の中心となっています。PCRベースのアッセイは、狂犬病の診断を確認するために何十年も利用されてきましたが、狂犬病感染を検出する主要な方法としてOIE(世界動物衛生機構)によって受け入れられました。リアルタイムRT-PCRアッセイは、リアルタイムデータを提供し、クローズドチューブシステムであり、セットアップ中の汚染のリスクを最小限に抑えます。DNAインターカレーションフルオロクロムリアルタイムRT-PCRアッセイは、高価なプローブを必要とせず、サンプルあたりのコストを最小限に抑え、プライマーが保存領域で設計されている場合、1つのウイルスに特異的ではなく、ウイルスの系統全体に特異的なアッセイ種が可能です。ここでは、最も発散性ウイルスIKOV、WCBVおよびLLEBVを含むリッサウイルス属全体のリッサウイルスを検出するパンリッサウイルスSYBRリアルタイムRT-PCRアッセイについて説明する。解離曲線解析と組み合わせて、このアッセイは、すべてのリサウイルス種を検出する利点を持つ、敏感で特異的です。このアッセイは、品質保証された環境を備えた多くの診断ラボで採用されており、動物およびヒト狂犬病の症例の堅牢で迅速かつ敏感な診断を可能にします。
2018年1月に分子方法論を用いて狂犬病の診断がOIEに受け入れられ、特にサンプルが最適でない場合や、アンテモーテ診断の場合に、狂犬病症例の確認におけるこれらの技術の利点を認識し、ライブウイルスや新鮮なサンプルのための要件がないため。リッサウイルスのPCRアッセイは、ゲノムがRNAであるにつれてPCRが開始される前に、逆転転写(RT)を必要とする。ゲノムの3’近位領域を検出するRT-PCRアッセイは、リサウイルス複製中に転写勾配が生じるため、最も敏感であると考えられている。一般的に使用されるRT-PCRアッセイは、エンドポイント(またはゲルベース)とリアルタイムの2つのカテゴリに大きく分けることができます。どちらの方法も機密性が高く、具体的です。しかし、リアルタイムアッセイには「リアルタイム」で結果を得ることや、完全に閉じたチューブシステムで実行されるなど、いくつかの付加的な利点があり、オペレータの汚染の可能性を低減します。リアルタイムアッセイを用いて得られたリッサウイルス特異的アンプリコンを検出するには、主に2つのアプローチがあります。1つ目は、蛍塩素とクエンチャーを含む加水分解プローブ(TaqManプローブなど)を利用します。プローブが増幅中に標的領域に結合すると、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が蛍光素とクエンチャーの解離をもたらし、得られた蛍光を測定することができる。2つ目は、増幅時に二重鎖DNAに結合するDNAインターカレーション色素(SYBRグリーンなどのフルオロクロム)を利用しています。結合したフルオロクロムは、各サイクルで検出される蛍光を放出し、製品のリアルタイム検出と定量を可能にします。任意のdsDNAへの結合の非特異的性質のために、解離曲線分析が行われ、反応の特異性を確認する。リアルタイムRT-PcRは、通常、長さが200 bp未満の小さなアンプリコンサイズのために迅速です。しかし、保存された領域でプライマーとプローブを設計するのに適した領域を特定することは困難であることが証明されるため、プローブの要件を取り除くことは明らかな利点です。
多くのリアルタイムRT-PcRは、RABV2の個々の株または系統を特異的に検出し、また属3、4、5、6の間でリッサウイルスを検出するように設計されています。 7,8,9.すべてのアッセイは、プライマー(および必要に応じてプローブ)配列が属を横切って保存される方法に依存する検出の限界を持ちます。実際、新しいウイルス株や新しいウイルス株は、非常に特異的なプローブベースのアッセイを無効にする可能性があります。リアルタイム検出(色素対プローブ)の選択は、意図したアプリケーションによって異なります。局所的に供給された脳材料に対してサーベイランスを行い、多数の陰性サンプルを期待する実験室では、安価なインターカリング色素の使用は賢明な選択です。SYBR Greenアプローチは、新規または発散性リサウイルスの存在がより制限されたプローブベースのアッセイによって検出されないスキャン監視を行う場合にも最適です。
リサウイルス属のすべてのメンバーは、症状が現れると致命的である狂犬病を引き起こす。ヒトおよび動物狂犬病の症例の大半は狂犬病ウイルス(RABV)によるもので、国内犬10である支配的な貯水池である。コウモリはリッサウイルスにとって重要な宿主貯水池であり、特徴付けされた2種のリッサウイルス種を除く全てがコウモリで直接同定されている- 生駒リッサウイルス(IKOV)とモコラウイルス(MOKV)-そして、これら2つのうち、IKOVはコウモリ宿主貯水池を持っていると推測されている。11.16の認識されたリッサウイルス種12に加えて、最近記載されている2つのリッサウイルスがあります:台湾コウモリリサウイルス(TWBLV)13とコタラチコウモリリサウイルス(KBLV)14。リッサウイルスは遺伝的に3つのフィログループに分けられ、RABVを含むリッサウイルスの大部分は、フィログループIに属する。しかし、最も発散性のリサウイルスはフィログループIIIに属し、RABVまたはフィログループIウイルス配列を標的とするように設計されたRT-PcRによって検出される可能性は低い。
ここで説明するアッセイは、2005年3月に最初に説明したリアルタイムプライマーペアJW12-N165を利用しています。プライマーは、元のアプリケーションがリサウイルス種を区別するためのプローブを用いたTaqManアッセイであったが、パンリサウイルスであるように設計された。その後、プライマー対が特異性におけるパン・リサウイルスであったことが確認され、WCBV15を含む利用可能な全てのライサウイルス種に対する2段階のSYBRリアルタイムアッセイを利用して達成された。プライマーペアは、インターカリングフルオロクロムを利用した1ステップRT-PCRリアルタイムアッセイで、認識された全16種のリサウイルス種の代表者を用いて検証した。この1ステップのリアルタイムアッセイは、迅速で敏感な、リッサウイルス特異的アッセイであり、プライマーの堅牢性が非常に発散性の高いリサウイルス種を同定するために設定されたことを示しています。
記載されているパンリサウイルスリアルタイムRT-PCRアッセイは、3つのフィログループ全体でリッサウイルスを検出する閉じたチューブ、ワンステップアッセイである。このアッセイは、死後の脳組織(最適な脳幹)、皮膚生検、連続採取唾液、または脳脊髄液(CSF)などのアンテモーテ・サンプルを含む、動物とヒト狂犬病の診断の両方で検証されています。このアッセイで利用されるプライマーは、最初に多くのOIE狂犬病研究所で使用され、EURLの熟練スキームで一貫して実行されているRABV、EBLV-1およびEBLV-23を区別するためにプローブベースのアッセイのために設計され、利用されました。続いて、これらのプライマーの「パンリサウイルス」の性質は、2段階のリアルタイムアッセイ15を用いて確認された。ここで説明するアッセイは、プライマーを利用して、閉管、高速システムを可能にするワンステップSYBRアッセイでRT-PCRをさらに最適化した。さらに、このアッセイを用いた狂犬病流行国での訓練は、クロスコンタミネーションと微量サンプル、試薬を貯蔵する施設、リアルタイムの施設を削減するための基本的なPPEおよび品質システムを備えたあらゆる実験室で実施する適合性を確認した。SYBR検出を備えたマシン。アッセイは非常に強く、分解されたサンプル3に対する感度が向上し、FATと100%の相関関係があります。プローブベースのアッセイと比較して、DNAインターカリング色素ベースのアッセイの主な利点の1つは、相対コストです。もう一つの利点は、アッセイが2つのプライマーのみを使用するため、以前に公開されたプローブベースのアッセイの弱点であったシーケンス発散による検出に失敗するリスクが少ないです。実際、すべてのリッサウイルス種(TWBLVおよびKBLVを除く)の代表者は、このアッセイを使用して検出され、プライマー部位全体でのTWBLVおよびKBLVの配列分析は、それらも使用して検出されることを強く示唆する有意な発散を明らかにしないこのメソッド。分析されたウイルス全体で観察される検出の範囲は、2つの主な要因によるものと考えることができる。第1は、RNAが臨床脳材料から単離されたため、希釈されていない各サンプル中のゲノムコピーの量は直接比較できないということです。RNAは、総RNAを1 μg/μLに調整することによって「正規化」された。しかし、そのサンプル内のウイルスゲノムRNAの割合は異なります。第2は、リッサウイルス配列の多様性であり、プライマー部位が保存領域に位置しているにもかかわらず、変動の位置が残っている。したがって、アッセイに対する感受性が低いリッサウイルスの大部分がフィログループIIおよびIIIウイルスであることは驚くべきことではない。解離曲線解析は必須パラメータを表し、プライマーダイマーの形成、または宿主ゲノム内の非特異的領域の増幅によって起こり得る偽陽性の結果を最小限に抑えます。実際には、これはまれな発生であり、解離曲線解析は、正しいサイズの従来のRT-PCRアンプリコンを視覚化するためにアガロースゲルを実行することに相当します。当研究室で収集したデータに基づき、許容されるTm値の範囲(77~80°C)が提供されています。個々のラボが社内データを照合し、範囲が転送可能であることを確認し、それに応じて修正することを強くお勧めします。増幅および解離プロットの両方からの結果の解釈は、正と負のコントロールおよびθ-actinの結果と共に、堅牢で再現可能な診断結果を可能にする。
このプロトコルの範囲外には、高品質のRNAを得るために使用されるRNA抽出方法があります。このプロトコルで分析されたすべてのRNAは、TRIゾルを用いて調製した。しかし、カラムおよびビーズベースの抽出キットを含む、多くの適切なグアニジウムベースの抽出RNA抽出プロトコルが利用可能です。リッサウイルス陽性(または陽性の疑いのある)サンプルの取り扱いは、国内で承認された認可されたバイオコンテインメント施設内でなければなりません。しかし、抽出された全RNAは非感染性であるため、低封じ込め実験室内で処理されます。使用される抽出方法に応じて、RNAを定量化および希釈する要件を評価する必要があります。TRIzolを含むフェノールベースの抽出のために、このステップが必要であり、gDNAを汚染するアッセイの阻害を防ぎます。しかし、カラムおよびビーズベースの抽出(特にDNA枯渇段階を有するもの)は、試験前に希釈を必要としない。
プロトコル全体を通じて、適切な井戸へのクロスコンタミネーションとサンプルの正確な添加を防ぐために、ケアと勤勉が使用される必要があります。試薬の計算とプレートレイアウトを含むスプレッドシートは、補足ファイルとしてダウンロードできます。きれいな仕事の表面、手袋の定期的な変更、各段階を分離するために障壁の先端および異なった部屋/UVキャビネットの使用を含むよい実験室の練習は汚染のチャンスを最小にする。テストが期待されるパラメータで実行されていることを確認するには、正と負のコントロールを含め、すべてのテスト サンプルを重複 (または三文) で実行する必要があります。
コントロールを含めることは、特に診断のために、任意のPCRの不可欠な機能です。陽性対照RNAは、CVS(チャレンジウイルス標準)感染マウス脳からバッチで調製し、バッチ間の一貫性を確保するために検証および校正した。対照RNAを定量し、1μg/μL.RNAに希釈し、シリアル希釈で少なくとも10-4(100pg/μLに相当)まで陽性の結果が得られたので、目的に適していると考えられた。陽性対照RNAを10-1アリコートで-80°Cで保存した。必要に応じて、アリコートを1:100に希釈し、1ng/μLで作動ストックを提供し、5μL単一使用アリコートで-80°Cで保存した。希釈された陽性対照RNAは、低レベル陽性サンプルを表し、アッセイの感度の低下が検出されたことを確実にするために使用された。Ct値を監視し、傾向を識別するために、各コントロールに対して「コントロール カード」が保持されました (表5)。表 5は、CVS 陽性コントロール サンプルC tおよび Tm値が複数の日および演算子に対して良好な実行間比較性を示し、アッセイが堅牢で再現性があることを保証しました。これらの測定値から逸脱した結果を調査し、必要に応じてサンプルを繰り返す必要があります。分子グレードの水は、試薬がリサウイルスRNAによる汚染から自由であることを確認し、陰性サンプルを確認するために、NTCとしてすべての実行に含まれていました。さらに、RNA抽出の有効性を確保するために、β-アクチンを別のチューブ内の試験試料と共に試験した。ライサウイルス陽性対照RNAは、β-アクチン陽性対照にも用いられた。他の内因性遺伝子または異種内部制御システムが利用されうる。これらのコントロールを使用すると、すべてのステップがテスト サンプルと同じ条件で分析されました。時折、サンプルが高度に分解された場合、または十分な宿主RNA(唾液またはCSFなど)が含まれなかった場合、内因性遺伝子PCRが失敗する可能性があります。この場合、ライサウイルスリアルタイムRT-PCR結果が陽性であった場合、独立したRNA抽出に関する確認- 元の試験または二次試験(従来のRT-PCRなどの分子のいずれか)によるRNA抽出中の汚染を除外する。、または FAT を使用します。診断サンプルの分析中に表4を使用すると、正しい解釈が保証されました。
狂犬病感染を確認するために使用される分子アッセイにかかわらず、サンガーシーケンシングを使用してリッサウイルス種を決定し、FATやウイルスの単離などのウイルス学における古典的な技術を決定するために調査をフォローアップし、可能にする必要があります。さらなるウイルスの特徴付けとOIEとWHOへの陽性症例の通知をサポートします。
The authors have nothing to disclose.
著者たちは、実験を完了する際の支援のためにエマ・ワイズさんとミス・ミーガン・ゴールディングさんに感謝したいと思っています。このプロトコルの開発は、英国環境・食糧・農村省(Defra)、スコットランド政府、ウェールズ政府の助成金[SV3500、およびSE0431]および欧州ウイルスアーカイブ・グローバル(EVAg)プロジェクトによって財政的に支援されました。欧州連合のHorizon 2020研究・イノベーション・プログラムから助成金を受け取ったNo 653316。
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |