זה בזמן אמת RT-PCR באמצעות הצבע הintercalating מתאים לאבחן זיהומים lyssavirus ירוס. השיטה מתחילה עם רנ א שחולצו מפני חשד כלבת לאחר המוות או דגימות שלאחר המוות, המפרט הכנה לערבב הורים, הוספת RNA, ההתקנה של מכונת בזמן אמת ופרשנות נכונה של תוצאות.
הנושא המולקולרי הוא מהיר, רגיש ומדויק, והפכו למרכז לאבחון כלבת. המערכת המבוססת על PCR מבוססת במשך עשורים כדי לאשר אבחון כלבת, אבל רק לאחרונה התקבלה על ידי OIE (הארגון העולמי לבריאות בעלי חיים) כשיטה העיקרית כדי לזהות זיהום בכלבת. בזמן אמת RT-PCR מספק נתונים בזמן אמת, והם מערכות סגורות tube, למזער את הסיכון לזיהום במהלך ההתקנה. DNA intercalating fluorochrome בזמן אמת RT-PCR בחני לא דורשים בדיקות יקרות, למזער את עלות לכל מדגם, וכאשר התחל מתוכננים באזורים שנשמרים, בחני כי הם ספציפיים ברחבי וירוס במקום ספציפי לווירוס אחד בלבד מינים אפשריים. כאן אנו מתארים את הפאן-lyssavirus ירוס SYBR בזמן אמת מזהה RT-PCR המזהה lyssavirus על פני סוג Lyssavirus , כולל וירוסים המפוצלים ביותר ikov, WCBV ו לואלין. בשילוב עם ניתוח עקומת הדיסוציאציה, הטיפול הזה הוא רגיש וספציפי, עם היתרון של זיהוי כל המינים lyssavirus. הבדיקה אומצה במעבדות אבחון רבות ובאיכות סביבה מובטחת, המאפשרת אבחנה איתנה, מהירה ורגישה של בעלי חיים ומקרי כלבת אנושיים.
האבחנה של כלבת בשיטות מולקולארית התקבלה על-ידי ה-OIE ב-20181, מזהה את היתרונות של טכניקות אלה באימות מקרי כלבת, במיוחד במצבים שבהם הדגימות הן תת-אופטימליות, או לאבחון הנתיחה, כאשר אין דרישה עבור וירוס חי או דגימות טריות. Pcr בחני עבור lyssaviruses דורשים תמלול הפוכה (RT) לפני PCR יכול להתחיל כמו הגנום הוא RNA. RT-PCR בחני אומר כי לזהות את 3 ‘ האזור האבובי של הגנום נחשבים רגישים ביותר, כמו מעברי הצבע הטרנססקריפט מתרחשים במהלך שכפול lyssavirus. השימוש הנפוץ ב-RT-PCR בחני יכול להיות מחולק בהרחבה לשתי קטגוריות, נקודת קצה (או ג’ל מבוסס) ובזמן אמת. שתי הגישות הן רגישות וספציפיות; עם זאת, בזמן אמת יש כמה יתרונות נוספים כגון קבלת תוצאות ב-‘ זמן אמת ‘ והוא מבוצע במערכת שפופרת סגורה לחלוטין, ובכך מפחית את הפוטנציאל לזיהום מפעיל. קיימות שתי גישות עיקריות כדי לזהות הגברה ספציפיים של lyssavirus המתקבלים באמצעות assays בזמן אמת. הראשון מנצל בדיקה הידרוליזה (כגון בדיקה TaqMan) המכילים fluorophore ו מקאורה. כאשר החללית נקשר לאזור היעד במהלך הגברה, את הפעילות האקסאוכירות של הפולימראז התוצאות של הדיסוציאציה של fluorophore ו הקונשר, המאפשר הזריחה והתוצאה להיות נמדד. השני מנצל את הצבע intercalating DNA (fluorochrome כגון SYBR גרין) הנקשר DNA כפול נטוש במהלך הגברה. Fluorochromes מאוגד פולט קרינה פלואורסצנטית כי הוא זיהה בכל מחזור, המאפשר זיהוי בזמן אמת וכימות המוצר. בשל האופי הלא ספציפי של איגוד לכל dsDNA, ניתוח עקומת הדיסוציאציה מבוצעת כדי לאשר את הספציפיות של התגובה. בזמן אמת RT-בדיקות הם מהירים בשל אמפליקון קטן גדלים, בדרך כלל פחות מ 200 bp באורך; עם זאת, זיהוי אזורים מתאימים לעיצוב התחל והבדיקות באזורים שמרו, יכול להוכיח מאתגרת, ולכן הסרת הדרישה לגשוש הוא יתרון ברור.
מספר בזמן אמת RT-בדיקות תוכננו עבור זיהוי באופן ספציפי זנים בודדים או ושלות של rabv2 וגם לזהות lyssaviruses על פני סוג3,4,5,6, 7,8,9. כל מאמר יהיה לקבל מגבלה של זיהוי תלוי כיצד שימור התחל (ובמידת הצורך, הבדיקה) רצפים הם על פני הסוג. אכן, זני וירוס המתעוררים או הרומן עשוי להפוך את הבדיקה הספציפית ביותר המבוססת על מבוסס-בדיקה יעיל. הבחירה של זיהוי בזמן אמת (צבען לעומת הבדיקה) יהיה תלוי ביישום מיועד. עבור מעבדה מנהל מעקב על חומר מקומי ממקור המוח ומצפה מספר גבוה של דגימות שליליות, השימוש בצבע intercalating זול הוא בחירה נבונה. הגישה הירוקה SYBR יהיה גם אופטימלי כאשר לנהל מעקב סריקה שבו הנוכחות של הרומן או מפוצלים lyssaviruses יישאר מבלי שיבחינו על ידי בדיקה מוגבלת יותר מבוססי המחקר.
כל חברי הסוג Lyssavirus לגרום כלבת המחלה, אשר קטלנית הסימפטומים פעם מופיעים. הרוב המכריע של המקרים של כלבת האדם והחיה נובע מנגיף הכלבת (RABV), המאגר הדומיננטי שהוא הכלב המקומי10. עטלפים הם מאגרי מארח חשוב עבור lyssaviruses וכל אלא שני מינים lyssaviruses המאופיינת זוהו ישירות בעטלפים – Ikoma lyssaviruses ירוס (IKOV) וירוס מוקדי (מוקדי) — ושל אלה שני, IKOV העריכו יש מאגר מארח בת 11. בנוסף ל -16 מינים lyssavirus ירוס12, ישנם שני lyssavirus שתוארו לאחרונה: העטלף ליסביסוירוס (twblv)13 ו kotalahti בת LYSSAVIRUS (kblv)14. Lyssaviruses יכול להיות מחולק גנטית לשלושה phylogroups, עם הרוב של lyssaviruses, כולל RABV, השייכים לקבוצת phylogroups I. עם זאת, lyssaviruses מפוצלים ביותר שייכים phylogroup III ו צפויים להתגלות על ידי RT-בדיקות שנועד למקד RABV או phylogroup אני וירוס רצפים.
הבקשה המתוארת כאן מנצלת את הזוג JW12-N165 בזמן אמת, שתוארה לראשונה ב-20053. התחל תוכנן להיות פאן-lyssavirus למרות היישום המקורי היה שיטת TaqMan עם הבדיקות כדי להבדיל מינים lyssavirus. בעקבות האישור כי הזוג הפריימר היה פאן-lyssavirus ביותר הושגה ניצול שיטת 2-step SYBR בזמן אמת על כל מיני lyssavirus זמין כולל WCBV15. הזוג הפריימר מתואר כאן בתוך צעד אחד RT-PCR בזמן אמת הניצול fluorochrome הintercalating, מאומת באמצעות נציגים מכל 16 מזוהה lyssavirus מינים. זה צעד אחד בזמן אמת שיטת הפעולה היא מהירה, רגיש, שיטת lyssavirus ירוס ספציפי וממחיש כי החוסן של התחל להגדיר לזהות מינים lyssavirus מפוצלים אפילו.
התבנית הפאן-lyssavirus בזמן אמת מתוארת שיטת הפעולה המתוארת היא שפופרת סגור, שיטת צעד אחת המזהה את הווירוסים ברחבי שלושת הפיללוהקות. הבחינה מאומתת עבור אבחון בעלי חיים וכלבת אנושית, כולל רקמת מוח שלאחר המוות (גזע מוחי אופטימלי), ודגימות לאחר המוות כגון ביופסיה לעור, שנאספו בצורה סדרתית, או נוזל שדרתי מוחי (שדרתי). התחל השימוש במערכת זו תוכנן לראשונה ונוצל לצורך בדיקה על בסיס המכשיר להבדיל בין RABV, EBLV-1 ו-EBLV-23, אשר נעשה בו שימוש במעבדות מעבדות רבות של כלבת ומבצעת בעקביות ב-eurl מיומנות המזימות. לאחר מכן, הטבע של ‘ פאן-lyssavirus ‘ של התחל האלה אושר באמצעות שיטת בזמן אמת של 2 שלבים15. הבקשה המתוארת כאן הייתה בשימוש בצבעי היסוד כדי למטב עוד יותר את ה-RT-PCR בשיטת SYBR בעלת שלב אחד, המאפשרת מערכת שפופרת סגורה ומהירה. יתר על כן, הכשרה במדינות כלבת אנדמיים באמצעות השיטה הזאת אישרה התאמה ליישם בכל מעבדה עם PPE בסיסי מערכות איכות כדי להפחית זיהום הצלב דגימות מעקב, מתקנים לאחסן את הריאגנטים ואת בזמן אמת מחשב עם זיהוי SYBR. ה100 הינו עמיד ביותר, ויש לו מתאם% עם השומן, עם רגישות משופרת לדגימות מפורקת3. אחד היתרונות העיקריים עבור שיטת ה-DNA לצבוע מבוסס צבען בהשוואה לחישוב מבוסס הבדיקה הוא העלות היחסית. יתרון נוסף הוא שהסטייה משתמשת רק בשתי התחל, ולכן יש פחות סיכון לגילוי כישלון בשל התפצלות רצף, אשר כבר חולשה במחקר שפורסם בעבר על ידי החוקרת. אכן, נציגי כל מיני וירוס lyssavirus (מלבד TWBLV ו KBLV) מזוהים באמצעות הטיפול הזה, וניתוח רצף של TWBLV ו KBLV על פני האתרים פריימר לא חושף סטייה משמעותית רומז כי הם יזוהו גם באמצעות שיטה זו. טווח הגבלת הזיהוי הנצפה על פני וירוסים שנותחו, יכול להיחשב כתוצאה משני גורמים עיקריים. הראשון הוא ש-RNA היה מבודד מחומר המוח הקליני, ולכן כמות עותקי הגנום בכל מדגם שלא מדולל אינו בדיוק המקבילה. RNA היה ‘ מנורמל ‘ על-ידי התאמת ה-RNA הכולל ל-1 μg/μL; עם זאת, שיעור של הגנום הנגיפי RNA בתוך המדגם הזה יהיה שונה. השני הוא המגוון של רצפי lyssavirus, למרות האתרים הפריימר להיות ממוקם באזורים שמרו, שם יישארו עמדות של וריאציה. לכן, זה לא מפתיע כי הרוב של lyssaviruses עם רגישות נמוכה יותר עבור השיטת הם phylogroup II ווירוסים III. ניתוח עקומת הדיסוציאציה מייצג פרמטר חיוני, מזעור תוצאה חיובית שקרית אשר יכול להתרחש באופן אחר בשל היווצרות של מבקיעות, או הגברה של אזור לא ספציפי הגנום המארח. במציאות, זהו מקרה נדיר וניתוח עקומת הדיסוציאציה הוא שווה ערך להפעלת ג’ל agarose כדי להמחיש בגודל הנכון של הגברה המקובלת RT-PCR. מגוון ערכי Tm מקובלים סופק (77-80 ° c), בהתבסס על הנתונים שנאספו במעבדה שלנו. מומלץ מאוד כי מעבדות בודדות לאסוף נתונים בתוך הבית כדי להבטיח את הטווח מועבר ולתקן בהתאם. פענוח התוצאות הן מחלקות הגברה והן מתווה הדיסוציאציה, לצד הפקדים החיוביים והשליליים ותוצאות ה-actin, מאפשר תוצאות אבחון איתנות ועמידות.
מחוץ לטווח של פרוטוקול זה היא שיטת החילוץ RNA המשמש להשגת באיכות גבוהה RNA. כל RNA שנותח בפרוטוקול זה הוכן באמצעות TRIzol; עם זאת, יש הרבה מתאימים guanidium מבוססי מבוסס בסיס RNA פרוטוקולים החילוץ זמין, כולל עמודה ומבוסס חרוז ערכות החילוץ. טיפול של lyssavirus חיובי (או חשד חיובי) דגימות חייב להיות בתוך מתקני biocontainment מורשה אישר בתוך המדינה. עם זאת, RNA הכולל שחולצו הוא לא זיהומיות, ולכן טיפל במעבדות לבלימה נמוכה. בהתאם לשיטת החילוץ בשימוש, הדרישה לכמת ולדלל את ה-RNA צריך להיות מוערך. עבור העקירות מבוססי פנול, כולל TRIzol, שלב זה נדרש ומונע עיכוב של הדרישה מזיהום gDNA; עם זאת, טור ו מבוסס חרוז (במיוחד אלה עם המחסור DNA הבמה) אינם דורשים דילול לפני בדיקות.
במהלך הפרוטוקול, חיוני כי טיפול וחריצות משמשים כדי למנוע זיהום צולב ותוספת מדויקת של דגימה לבארות הנכון. גיליון אלקטרוני עם חישובים מגיב ופריסת צלחות זמינים להורדה כקובץ משלים. אימון טוב במעבדה, כולל משטחי עבודה נקיים, שינויים קבועים של כפפות, שימוש בתיאורי מכשול וחדרים שונים/ארונות UV כדי להפריד כל שלב יהיה למזער את הסיכוי לזיהום. כדי לוודא שהבדיקה מופיעה עם פרמטרים צפויים, יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים, וכל דגימות הבדיקה פועלות בכפולות (או בטרילקאט).
הכללת הפקדים היא תכונה חיונית של כל ה-PCR, במיוחד לאבחון. שליטה חיובית RNA הוכנו מ-קורות חיים (האתגר תקן וירוס) נגוע מוחות העכבר בקבוצות מאומת מכויל כדי להבטיח עקביות בין קבוצות. RNA הבקרה היה ככמת ו מדולל 1 μg/μL. RNA שעבורו תוצאה חיובית הושגה בדילול סדרתי לפחות 10-4 (שווה ל 100 Pg/μl) נחשב כמתאים למטרה. ה-RNA החיובי היה מאוחסן ב-80 ° c ב -10-1 . כאשר נדרש, סדרת מחלקים היה מדולל 1:100 כדי לספק מניות עבודה ב 1 ng/μl ומאוחסן ב-80 ° צ’ ב 5 μl שימוש יחיד סדרת מחלקים. בקרת מדולל חיובי RNA שימש לייצוג דגימות חיוביות ברמה נמוכה, כדי להבטיח כי כל הפחתה ברגישות של המנה זוהתה. הוחזק ‘ כרטיס בקרה ‘ עבור כל פקד כדי לנטר את ערכי ה-t ולזהות מגמות (טבלה 5). טבלה 5 הפגינו טוב בין הפעלה בין השוואת היכולת של בקרת קורות החיים CT ו-tm באמצעות מספר ימים ואופרטורים, מתן ביטחון כי הכדאיות היא איתנה ומוכחת. יש לחקור תוצאות הסטות ממידות אלה ולבדוק דגימות חוזרות במידת הצורך. מים כיתה מולקולרית נכלל בכל ריצה כמו NTC כדי לאשר את הריאגנטים היו ללא זיהום עם RNA lyssavirus ולאשר דגימה שלילית. יתר על כן, כדי להבטיח את היעילות של החילוץ RNA, בדקו במקביל את דגימות הבדיקה בצינור נפרד. בקרת lyssavirus שליטה חיובית היה גם בשימוש עבור שליטה חיובית-actin. גנים אנדוגניים אחרים או מערכות בקרה פנימית הטרוולוגי יכולים להיות מנוצלים. השימוש בפקדים אלה מבטיח שכל הצעדים נותחו תחת אותם תנאים כמו דגימות הבדיקה. מדי פעם, אם המדגם היה מושפל מאוד או לא להכיל מספיק RNA מארח (כגון רוק או שדרתי), ה-PCR גן אנדוסוגני יכול להיכשל. במקרה זה, כאשר lyssavirus בזמן אמת התוצאה RT-PCR היה חיובי, אישור על שאיבת RNA עצמאית-כדי לשלול זיהום במהלך חילוץ RNA על המבחן המקורי או על ידי בדיקה משנית (או מולקולרית, כגון המקובלת RT-PCR) , או FAT. השימוש בטבלה 4 במהלך ניתוח מדגם אבחוני הבטיח את הפרשנות הנכונה.
ללא קשר לשיטה המולקולרית המשמשת לאישור זיהום כלבת, מעקב אחר חקירות באמצעות רצף שומנים כדי לקבוע את מיני הווירוסים וטכניקות קלאסיות בוירולוגיה כגון בידוד FAT או וירוס, יש לבצע גם כדי לאפשר עוד מאפיין וירוס ותמיכה הודעה של מקרים חיוביים ל-OIE ומי.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות מיס אמה וייז וגברת מייגן גולדינג לסיוע בהשלמת הניסויים. הפיתוח של פרוטוקול זה היה נתמך מבחינה כספית על ידי מחלקת בריטניה לאיכות הסביבה, מזון וכפריים (defra), הממשלה הסקוטית והממשלה הוולשית על ידי מענקים [SV3500, ו SE0431] ועל ידי הפרויקט העולמי ארכיון הווירוסים (evag) האירופי ש קיבל מימון של אופק 2020 של האיחוד האירופי תוכנית מחקר וחדשנות תחת הסכם מענק לא 653316.
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |