結核複合体を研究するための感染モデルとしての無脊椎動物ガレリアメロネラの使用
Summary
ガレリアメロネラは最近、結核複合体の再現性、安価、倫理的に許容可能な感染モデルとして設立されました。ここでは、生物発光マイコバクテリウム・ボビスBCGルクスを用いたG.メロネラの正常な感染を確立するためのステップを説明し、実証する。
Abstract
結核は感染症死亡率の主要な世界的原因であり、世界の人口のおよそ4分の1が結核菌に感染していると考えられています。何十年もの研究にもかかわらず、病原性生物としての結核の成功の背後にあるメカニズムの多くは調査されるべきであり、より安全で効果的な抗マイコバクテリア薬の開発は、その上昇に取り組むために緊急に必要とされ、薬剤耐性結核の広がり。しかし、結核研究の進行は、高価で時間がかかり、倫理的に困難な伝統的な哺乳類感染モデルによってボトルネックとなっています。以前は、M.結核複合体のメンバーのための新規、再現性、低コスト、高スループットおよび倫理的に許容可能な感染モデルとして、昆虫ガレリアメロネラ(より大きなワックス蛾)の幼虫を確立しました。ここでは、生物発光マイコバクテリウム・ボビスBCGルクスを用いたG.メロネラの維持、調製、および感染について説明する。この感染モデルを用いて、マイコバクテリア用量依存性が観察され、生物発光測定を用いた生体内マイコバクテリア負荷の迅速な読み出しが容易に達成でき、再現可能である。トランスクリプトーミクス分析用に完全にアノテ付きゲノムが欠如するなどの限界は存在するが、遺伝的に類似した昆虫に対するオンロジカルな分析を行うことができる。結核の低コスト、迅速かつ倫理的に許容可能なモデルとして、G.メロネラは、薬剤の有効性と毒性を決定し、従来の哺乳動物の使用前に比較マイコバクテリアウイルス性を決定するために、事前スクリーンとして使用することができますモデル。G.メロネラ-マイコバクテリアモデルの使用は、現在結核研究で使用されている動物の実質的な数の減少につながります。
Introduction
結核(結核)は、年間900万人の新しい症例と150万人の死亡者1人と世界の公衆衛生に対する主要な脅威です。さらに、世界人口の4分の1が、結核菌(Mtb)の原因原因剤に感染していると推定されている。感染した集団の中で、5−10%が生涯にわたって活動性結核疾患を発症する。さらに、多剤耐性(MDR)および広範囲薬剤(XDR)耐性Mtbの出現と広がりは、疾病管理に深刻な脅威をもたらし、123カ国が少なくとも1つのXDR症例1を報告している。結核の治療は、少なくとも4つの抗マイコバクテリア薬のカクテルを必要とします, イゾニアジドとリファンピシンは、6ヶ月の最小期間のために処方されています;治療は、多くの場合、複雑な副作用や毒性に関連付けられています。結核に対する唯一のライセンスワクチンからの保護,マイコバクテリウムボビスバチルスカルメット-ゲリン (BCG),可変 2.結核の病因の不完全な理解は、新しい治療およびワクチン接種戦略の開発を著しく妨げる。
何十年もの間、動物感染モデルは、結核研究が感染に対する基本的な病因と宿主応答を理解し、新規の抗マイコバクテリア剤、免疫療法および新しいワクチン候補を評価するために不可欠であった3、 4.しかし、結核感染の病因と進行が複雑であり、疾患の全スペクトルと重要な特徴を模倣する単一の動物モデルがないため、結核の動物感染モデルを用いた研究は難しいことで知られています5 、6.さらに、動物実験は高価であり、引き受けるには時間がかかり、完全な倫理的正当化が必要です。それにもかかわらず、結核の動物感染モデルは、非ヒト霊長類(例えば、マカク)、モルモット、ウサギ、ウタ、ブタ、マウスおよびゼブラフィッシュに記載されており、それぞれにその制限3、4を有する。マウスモデルは、コスト、交配ラインの利用可能性、感染の再現性および免疫学的試薬の豊富さのために最も一般的に使用されるモデルである。しかし、それらは通常、潜在結核感染(LTBI)6の特徴である低酸素症の領域に関連する肉芽腫を形成しない。モルモットはMtb感染の影響を非常に受けやすく、病理や初期肉芽腫の形成はヒトと同様であり、ワクチン検査で広く使用されています。しかし、免疫学的試薬の欠如は、感染モデル7としての使用を妨げる。ゼブラフィッシュは、小型、迅速な繁殖、高度な遺伝的ツールによる初期前臨床試験における大規模なスクリーニングに適していますが、解剖学的および生理学的に人間とは異なり、ヒトの影響を受けやすくなっています。マイコバクテリウム・マリナム感染症3.ヒトMtb感染に最も近い動物モデルは、非ヒト霊長類(例えば、マカク)であるが、それらは高価であり、その使用をかなり制限する重要な倫理的および実用的な考慮事項を有する8。
より大きなワックス蛾またはハニカム蛾の昆虫幼虫、ガレリアメロネラは、細菌および真菌病原体9の様々な感染モデルとしてますます人気が高まっており、新しい抗菌薬候補のスクリーンとして10. G. メロネラは、脊椎動物のそれと高い程度の構造的および機能的類似性を共有する高度な自然免疫系(細胞および体液防御からなる)による成功した無脊椎動物モデルです11.これには、ヘモサイトによる病原体の食細胞症(哺乳類のマクロファージおよび好中球に機能的に類似)12、13、抗微生物ペプチド(AMP)の産生および循環などの免疫機構が含まれる。G.メロネラ11のヘモリンパ内の補体様タンパク質(哺乳類の血液に類似)。モデルとしてのG.メロネラ幼虫の他の利点9、14、15は、簡単な操作と感染を可能にするその大きなサイズ(20−30ミリメートル)だけでなく、組織のコレクションを含みます分析のためのヘモリンパ、2)37°Cでの容易な維持、ヒト病原体の研究に適した、3)麻酔を必要としない注射による精密な感染、4)抗菌剤の有効性は、評価のためのより少ない薬剤を利用して評価することができ、5)の欠如哺乳類の使用に比べて倫理的な制約は、6)大きなグループサイズは、より大きな再現性を可能にする動物モデルと比較して使用することができ、7)感染実験のためのより短い時間が必要とされる。
最近の研究では、G.メロネラは、生物発光M.ボビスBCGルクス、ワクチン株およびメンバーの遺伝子改変バージョンによる感染の病因を研究するための新しい感染モデルとして使用できることを実証しました。Mtb複合体 (MTBC)16の .G.メロネラは、以前は非結核マイコバクテリア(NTM)の感染モデルとして使用されてきましたが、主にM.マリナムおよびマイコバクテリウム膿瘍17、18を用いた研究は、MTBCを用いた研究に限定されています。Li et al.16の.Mtbの代理として封じ込めレベル(CL)2で使用できるバイオルミネッセンス非病原性マイコバクテリア株は、病原性マイコバクテリアに対する安全性と実用性の利点を提供します。BCGルクスに感染した後、幼虫は早期肉芽腫様構造を開発し始め、結核感染16の確立における自然免疫の役割に関する貴重な洞察を提供することができる。さらに、この単純な無脊椎動物感染モデルは、再現性のために制御された課題と複数の反復を組み込んだ結核病因の迅速かつ低コストかつ信頼性の高い評価を提供する可能性を有する。さらに、このモデルは、早期開発における新規な抗結核薬およびワクチン候補のスクリーニングに使用される可能性を有し、実験における動物の総数を減少させる。宿主および病原体構造の変化を測定する能力、転写物およびプロテオームは、薬物標的を決定し、新規薬物および治療ワクチンの作用機序を評価することも有利である。
ここでは、マイコバクテリア感染に対する生物発光M.ボビスBCGルクス接種およびG.メロネラ幼虫の調製のための実験プロトコルと、幼虫とマイコバクテリアの両方の決定について説明します。感染に応じて生存する。
Protocol
Representative Results
Discussion
感染モデルとしてのG.メロネラの使用は、ウイルス、宿主病原体相互作用の研究のための細菌および真菌病原体の数のために確立され、および新規治療のためのスクリーンとして10,22。以下の議論は、MTBCの感染モデルとしてG.メロネラを使用するための実験的手順に基づいている。
実験前の素朴な幼虫の健?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、PRLとYL(BB/P001262/1)に授与されたバイオテクノロジー・生物科学研究協議会(BBSRC)の助成金と、PRLに授与された国立研究動物の置き換え、精製、還元のための国立センター(NC3R)の助成金によって支援されました。SMN、BDR、および YL (NC/R001596/1)。
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
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