השימוש חסרי חוליות גלריה מלאבלה כמודל זיהום לחקור את מתחם שחפת של פטרת
Summary
גלריה מלאבלה הוקמה לאחרונה כמודל מבחינה מוסרית, זולה, ומקובלת מבחינה אתית עבור קומפלקס השחפת של החיידק . כאן אנו מתארים ולהדגים את הצעדים שננקטו כדי ליצור זיהום מוצלח של G. מלובלה עם biלומילאוקטריה בואוויס bcg lux.
Abstract
שחפת היא הגורם הגלובלי המוביל של תמותת מחלות זיהומיות ובערך רבע מאוכלוסיית העולם הוא האמין להידבק בשחפת של פטרת. למרות שנים רבות של מחקר, רבים מן המנגנונים שמאחורי ההצלחה של שחפת משנת השחפת כאורגניזם פתוגניים להישאר נחקר, ופיתוח בטוח יותר, תרופות antimycobacterial יעיל יותר יש צורך דחוף להתמודד עם עלייה ו התפשטות של שחפת עמיד בפני סמים. עם זאת, ההתקדמות של מחקר שחפת היא בקבוק בצווארי מודלים מסורתיים של זיהום היונקים היקרים, זמן רב, ומאתגרת מבחינה אתית. בעבר הקמנו את הזחלים של גלריה החרק מובלה (עש שעווה גדול יותר) כרומן, הדבקה, עלות נמוכה, תפוקה גבוהה, מודל זיהום מקובל מבחינה אתית עבור חברי מתחם שחפת M . כאן אנו מתארים את התחזוקה, ההכנה, והזיהום של G. מלבלה עם biלובאוקטריה בואוויס bcg lux. באמצעות מודל זה זיהום, מינון פטרת תלוי התקפה אלימה ניתן לצפות, ואת הבדיקה המהירה של נטל vivo פטרת באמצעות מדידות biלומינסנציה הוא בקלות השגה הניתן לקריאה. למרות שההגבלות קיימות, כגון חוסר הגנום המלא לניתוח הטרנססקריפט, ניתוח אונטולוגי נגד חרקים דומים מבחינה גנטית ניתן לבצע. כעלות נמוכה, מהירה, ומקובל המודל המקובל עבור שחפת, G. מלאבלה ניתן להשתמש בתור המסך מראש כדי לקבוע את יעילות הסמים ואת הרעילות, וכדי לקבוע את התקפה השוואתית מפטרת לפני השימוש של יונקים קונבנציונליים ודלים. השימוש G.מלאבלה-מודל החיידק יוביל לירידה במספר משמעותי של בעלי חיים המשמשים כיום במחקר שחפת.
Introduction
שחפת (TB) הוא איום גדול על בריאות הציבור העולמי עם 9,000,000 מקרים חדשים בשנה ו 1,500,000 מקרי מוות1. בנוסף, מעריכים כי רבעון אחד של אוכלוסיית העולם נגוע בסוכן סיבתי של המחלה, שחפת של פטרת (Mtb). בין האוכלוסייה הנגועה, 5-10% יפתחו מחלת שחפת פעילה במהלך חייהם. יתר על כן, הופעתה והתפשטות של עמיד בפני סמים עמידים (MDR) ובאופן מקיף-סמים (XDR) עמידים Mtb מהווה איום רציני לבקרת מחלות, עם 123 מדינות לדווח לפחות אחד xdr מקרה1. הטיפול בשחפת דורש קוקטייל של לפחות ארבעה תרופות נגד פטרת, אשר isoniazid ו גריסופלובין מרשם עבור משך המינימום של שישה חודשים; טיפול משויך לעיתים קרובות עם תופעות לוואי מורכבות ורעלים. הגנה מפני החיסון היחיד ברישיון נגד שחפת, משתנה בונגד בוגקטריה באקלוס-Guérin(bcg). הבנה לא מלאה של הפתוגנזה של TB הסלים באופן משמעותי את התפתחותם של אסטרטגיות טיפוליות חדשות וחיסונים.
במשך עשרות שנים מודלים לזיהום בעלי חיים היו חיוניים עבור מחקר TB להבין את בסיסי התגובה ואת תגובת מארח לזיהום, וכלה להעריך הרומן אנטי פטרת סוכנים, אימונוtherapeutics ומועמדים חדשים חיסון3, 4. עם זאת, מחקר באמצעות מודלים לזיהום בעלי חיים של tb הוא קשה לשמצה כמו פתוגנזה והתקדמות של הידבקות בשחפת הם מורכבים, ואין מודל בעלי חיים יחיד מחקה את הספקטרום המלא ותכונות חשובות של המחלה5 ,6. יתרה מזאת, ניסויים בבעלי חיים הם יקרים, זמן רב להתחייב ודורשים צידוק מוסרי מלא. אף על פי כן, מודלים לזיהום בעלי חיים של TB תוארו בפרימטים שאינם אנושיים (למשל, קופי מאני), שרקנים, ארנבים, בקר, חזירים, עכברים ודגי זברדג, עם כל אחד שיש להם את המגבלות שלהם3,4. מודל murine הוא המודל הנפוץ ביותר בשל עלות, זמינות של קווים מסוג, שימוש בזיהום ושפע של ריאגנטים אימונולוגיים. עם זאת, הם לא בדרך כלל טופס גרשמות הקשורים באזורים של היפוקסיה האופייניים לזיהום שחפת סמויה (LTBI)6. שרקנים הם רגישים מאוד לזיהום Mtb , עם היווצרות גרגירומה מוקדם דומה לאלה בבני אדם, והם בשימוש נרחב בבדיקות החיסון; ובכל זאת, העדר ריאגנטים אימונולוגיים מסלים את השימוש בהם כמודל זיהום7. Zebrafish מתאימים ההקרנה בקנה מידה גדול בשלב מוקדם מחקרים טרום קליניים בשל גודלם הקטן, הרבייה מהירה וכלים גנטיים מתקדמים, אבל הם מבחינה אנטומית ושונה פיזיולוגית לבני אדם והם רגישים רק ל הזיהום של פטרת מרינום3. מודלים של בעלי חיים הדומים ביותר לזיהום האנושי Mtb הם בני אדם שאינם יונקים אנושיים (למשל, מקוק), אבל הם יקרים ויש להם שיקולים אתיים ומעשיים משמעותיים אשר מגביל במידה ניכרת את השימוש8.
זחל חרק של עש שעווה גדול או החלת דבש, גלריה מלאבלה, הפכו פופולרי יותר ויותר כמודל זיהום עבור מגוון של פתוגנים חיידקים ופטריות9, וכמסך עבור מועמדים הרומן מיקרוביאלית סמים 10. G. מלונולה היא מודל חסרי חוליות מוצלח בשל המערכת החיסונית מתוחכמת שלה (מורכב הגנות הסלולר וההומוראלית) החולקת רמה גבוהה של דמיון מבניים ופונקציונלי זה של בעלי חוליות11 . זה כולל מנגנונים החיסונית כגון phagocyציטוזה של פתוגנים על ידי הומוציטים (פונקציונלית דומה למקרופאג ונויטרופילים)12,13, הייצור והסירקולציה של אנטי חיידקים פפטידים (אמפר) ו משלים כמו חלבונים בתוך המוליקמ (מקבילה לדם של יונקים) של G. מלבלה11. יתרונות אחרים9,14,15 של G. מלונולה הזחלים כמודל כוללים 1) גודל גדול שלהם (20-30 מ”מ) אשר מאפשר מניפולציה קלה וזיהום, כמו גם אוסף של רקמה המוליקמ לניתוח, 2) תחזוקה קלה ב 37 ° c, תואם לחקר פתוגנים אנושיים, 3) זיהום מדויק על ידי הזרקה ללא צורך הרדמה, 4) היעילות של סוכנים מיקרוביאלית ניתן להעריך ניצול פחות סמים עבור הערכה, 5) חוסר אילוצים מוסריים בהשוואה לשימוש ביונקים, 6) גדלים של קבוצות גדולות ניתן להשתמש בהשוואה למודלים של בעלי חיים המאפשרים שימוש ביותר, ו -7) פעמים קצרות יותר עבור ניסויים בזיהום נדרשים.
במחקר שנערך לאחרונה, הדגמנו כי G. מלונו יכול לשמש כמודל זיהום הרומן לחקר הפתוגנזה של זיהום על ידי biלומינטאז M. סטרפטקוקוס bcg lux, גרסה ששונתה גנטית של זן החיסון וחבר של קומפלקס Mtb (mtbc)16. בעוד G. מלונולה כבר שימש בעבר כמודל זיהום עבור חיידקים שאינם בעלי בקטריות (ntm), בעיקר M. מרנום ו- פטרת abscessus17,18, מחקרים באמצעות mtbc מוגבלים ל זה של לי ואח ‘16. ביולומילטיות ללא פתוגניים זנים מפטרת, אשר ניתן להשתמש ברמת הבלימה (CL) 2 כפונדקאית עבור Mtb, להציע את היתרונות של בטיחות ומעשיות על פני החיידקים פתוגניים. לאחר הזיהום עם BCG lux, הזחלים מתחילים לפתח מבנים כמו גרגירומה מוקדם, אשר יכול לספק תובנה יקר לתפקיד של חסינות מולדת בהקמת שחפת זיהום16. בנוסף, זה מודל זיהום פשוט חסרי חוליות יש את הפוטנציאל לספק מהירה, בעלות נמוכה, הערכה אמינה של שחפת הפתוגנזה המשלבת אתגר מבוקר ומשכפל מרובים עבור התוכסות. יתר על כן, המודל יש את הפוטנציאל לשמש למסך הרומן anti-TB מועמדים החיסון בפיתוח מוקדם, הפחתת מספר כולל של בעלי חיים בניסויים. היכולת למדוד שינויים במבנה הפונדקאי והפתוגן, הטרנס והפרוטפה כדי לקבוע יעדי סמים ולהעריך מנגנוני פעולה של תרופות מעשיות וחיסונים טיפוליים, גם הם יתרון.
כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים הניסיוניים להכנת ביולומינסיום . סטרפטקוקוס bcg lux לוקס ו -g. מרכך זחלים עבור זיהום פטרת, כמו גם את הנחישות של הזחל וגם מפטרת הישרדות בתגובה לזיהום.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש ב -G. מלאבלה כמודל זיהום הוקם עבור מספר פתוגנים חיידקיים ופטרייתיים לחקר התקפה אלימה, הפתוגן הפונדקאי אינטראקציה, וכמסך עבור הרומן therapeutics10,22. הדיון הבא מבוסס על הליך ניסיוני לשימוש G. מלאבלה כמודל זיהום עבור mtbc.
בריאותם של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה היה נתמך על ידי מענקים של ביוטכנולוגיה ומועצת המחקר הביולוגי מחקר (BBSRC), הוענק PRL ו YL (BB/P001262/1), ואת המרכז הלאומי להחלפת, עידון וצמצום של בעלי חיים במחקר (NC3Rs) הוענק PRL, SMN, BDR, ו YL (NC/R001596/1).
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. . Global tuberculosis report 2018. , (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research – where is the beef?. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella – a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis – BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
