1. Collecte de données de cartographie optique Effectuer la cartographie optique cardiaque à l’aide d’un large éventail de modèles expérimentaux, y compris intacts et isolés cœurs entiers6,18, atri14isolés,19, coins ventriculaires20, tranches cardiaques 21 Ans, états-unis , 22, et monocouches cellulaires23. Voir les références associées pour les conceptions expérimentales pour recueillir des données brutes de cartographie optique à partir de ces préparations. A condition que les données obtenues puissent être converties en pile tiff ou enregistrées dans un . Fichier MAT, il doit être analysable à l’aide d’ElectroMap. Cela comprend les données de dimensions variables (carré/rectangulaire) et les résolutions (maximum testé actuellement 2048 pixels x 2048 pixels). 2. Installation et démarrage de logiciels REMARQUE: Ci-dessous sont détaillées les deux méthodes d’installation et d’exécution ElectroMap – soit dans MATLAB exécuter à partir du code source (.m) ou comme un fichier exécutable autonome (.exe pour les fenêtres). Le logiciel final et sa fonctionnalité sont invariants entre les deux options d’configuration (autres que quelques différences dans la navigation d’annuaire). Par conséquent, les principales considérations pour le choix de la version à installer sont l’accès à MATLAB et les boîtes à outils requises et si l’accès au code source est souhaité. Dans la mesure du possible, il est recommandé d’utiliser la version MATLAB pour des temps de démarrage plus rapides, des délais de traitement plus courts et des rapports d’erreur plus faciles. Configuration 1 : Exécution de l’électromap dans MATLAB Installer MATLAB. ElectroMap a été conçu dans MATLAB 2017a, cependant, le logiciel a été testé pour une utilisation dans toutes les versions ultérieures de MATLAB (jusqu’en 2018b au moment de la rédaction). Les boîtes à outils suivantes sont requises : Traitement d’images, traitement des signaux, statistiques et apprentissage automatique, et ajustement des courbes. Téléchargez/clonez tous les fichiers du dernier «code source» de ElectroMap à partir du référentiel GitHub (https://github.com/CXO531/ElectroMap). Décompressez le contenu téléchargé à un endroit désiré. Ouvrez MATLAB et naviguez vers l’emplacement du dossier hébergeant le code source ElectroMap. Ensuite, ouvrez le fichier ElectroMap.m et appuyez sur exécuter dans l’éditeur, ou alternativement taper ElectroMap dans la fenêtre de commande et appuyez sur RETURN. Cela va démarrer l’interface utilisateur ElectroMap, Figure 1A. Configuration 2: Fichier Standalone .exe Téléchargez le fichier d’installateur : https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI. Suivez les instructions dans l’installateur, qui téléchargera le temps d’exécution MATLAB requis à partir du web aux côtés du logiciel ElectroMap. Exécuter ElectroMap.exe.REMARQUE : Le temps de démarrage de la version autonome peut prendre plusieurs minutes. 3. Chargement et prétraitement d’images Appuyez sur Sélectionnez le dossier et naviguez vers l’emplacement du fichier de données à analyser. Cela remplira la boîte de liste de gauche avec tous les fichiers dans ce répertoire qui sont du type de fichier correct (.tif ou . MAT). . Les fichiers MAT ne doivent contenir que la variable de pile d’images.REMARQUE : Seuls les dossiers et non les fichiers individuels apparaîtront lorsque vous naviguerez dans le sélecteur d’annuaires. Sélectionnez le fichier à charger à partir de l’interface et appuyez sur Charger Images. Une fois chargé, le premier cadre apparaîtra, et le contour rouge indiquera le seuil automatique de l’image. Si nécessaire, rechargez les ROI déjà utilisés en sélectionnant Save/Load ROI. Dans ce cas, sautez l’étape 3.3. Par défaut, le seuil est basé sur les intensités de pixels dans la première image. Si vous le souhaitez, modifiez ceci à un seuil basé sur l’amplitude du cours de temps de signal en modifiant l’option dans l’image pour le menu de dépérage de seuil. Veuillez noter qu’une fois le seuil sélectionné, il est ensuite appliqué pour l’ensemble de la pile d’images. Si vous le souhaitez, changer l’option de seuil en manuel, qui activera le curseur pour ajuster manuellement le seuil d’image. En outre, les images de cultures (Crop Image) et/ou dessinent une région d’intérêt personnalisée (Custom ROI) pour analyse en sélectionnant la case à cocher (es) appropriée en dessous des options de seuil. Notez que des options avancées pour la sélection de la région d’intérêt, telles que le nombre de zones sont disponibles à partir de la sélection roi du menu supérieur. Une fois qu’un seuil approprié a été appliqué, appuyez sur Process Images pour appliquer le traitement. Les paramètres de traitement sont détaillés ci-dessous (étape 3.4.1-3.4.5). À ce stade, assurez-vous que les réglages corrects de la caméra ont été entrés. Il s’agit de la taille des pixels en m (IMPORTANT : il s’agit de la taille du pixel d’image, et non de la taille des pixels qui composent la puce ou le matériel équivalent dans l’appareil d’imagerie) et Framerate en kHz. Pour l’inversion de signal, cochez la case de contrôle Invert Data pour activer. Si le signal fluorescent signalé est inversement proportionnel au paramètre d’intérêt (comme pour les colorants potentiométriques couramment utilisés), le signal peut être inversé. Pour le filtrage spatial, sélectionnez Gaussian ou Average dans le menu du noyau. La taille de la zone moyenne spatiale est contrôlée par l’entrée taille adjacente au menu de déclassement du noyau (c’est-à-dire 3 résultats dans un noyau de filtre de 3 pixels x 3 pixels). Lors de l’application d’un filtre Gaussian, l’écart standard peut également être réglé à partir de l’entrée Sigma. Pour la correction de base, sélectionnez Top-hat24 ou polynomial (4e ou 11e degré) correction25 du menu Baseline. La correction peut être appliquée à chaque pixel individuellement (long temps de traitement) ou comme une moyenne de l’image entière (plus rapide mais suppose des modifications de base homogènes). La correction du chapeau supérieur peut également être modifiée en définissant la longueur du chapeau supérieur en millisecondes, à côté du menu de sélection de base. La longueur du noyau Top-Hat devrait être supérieure à l’échelle de temps des potentiels d’action individuels/transitoires de calcium. Pour le filtrage temporel, sélectionnez Savitzky-Goaly ou le filtrage d’impulsion infinie (IIR) à partir du menu De filtrage.REMARQUE : À l’autre pas du signal moyen tissulaire qui apparaît en bas à gauche, le filtrage temporel est appliqué à chaque pixel individuellement au moment de la quantification des paramètres à partir des plages d’images moyennes de l’ensemble. Cela a été mis en œuvre pour réduire le temps de traitement en filtrant de petites sections de données au besoin plutôt que des fichiers entiers. Pour la suppression du cadre, notez que si l’option Supprimer les cadres est sélectionnée, de grands pics avec amplitude supérieur au signal d’intérêt peuvent être supprimés de l’ensemble d’images. Cela peut être utile dans les jeux de données au rythme optique tels que le rythme optogénétique où la dépolarisation est initiée par l’activation optique d’opsines telles que channelrhodopsin211,12.REMARQUE : Comme la suppression du cadre pourrait introduire des changements d’étape non physiologiques dans les signaux d’image, le filtrage temporel peut introduire des artefacts dans les données et n’est donc pas recommandé ici. Notez que le signal sera segmenté une fois que Process Images aura été sélectionné en fonction des options dans le cadre des options de segmentation,mais cela peut être rapidement modifié sans retraitement de l’ensemble de données (voir la section 4). 4. Segmentation des données et moyenne des ensembles REMARQUE : Une fois le fichier traité, les pics dans le signal moyen tissulaire (trace inférieure droite, figure 1A)auront été détectés et étiquetés par des cercles rouges. Seuls les pics au-dessus d’un seuil fixé (ligne bleue sur trace qui est fixée par Seuil de pic) sont comptés. De plus, les pics ne sont comptabilisés que s’ils sont suffisamment retardés par rapport aux pics précédents, fixés par l’entrée Min Peak Distance. Le signal est ensuite segmenté en fonction des pics détectés. Tout d’abord, la longueur effective du cycle (CL) de chaque pic est calculée en mesurant le temps entre elle et le pic suivant. Si un certain nombre de pics (fixés par Min Number of Peaks input) ont des CL similaires (seuil pour lequel est fixé par entrée limite minimale), alors ils sont regroupés et le CL moyen pour ces pics calculé. Pour une segmentation plus poussée des données, appuyez sur Segment Signal. Les options de sous-segmentation sont les suivantes : Aucun , tous des pics avec le même CL regroupés ; Tous les segments depics n dans les temps Constants De CL (lespics n sont définis par l’entrée de taille du segment) sont identifiés ; Dernière – Derniersn pics avant un changement CL sont identifiés et regroupés, et tous les autres ne sont pas analysés; et Single Beat – Cela équivaut à l’application de la segmentation All avec despics n 1, et donc aucun regroupement ou ensemble en moyenne (voir 4.5) sont appliqués. Cela peut être appliqué en sélectionnant le bouton Single Beat. Appliquer la segmentation personnalisée du signal en zoomant sur un moment d’intérêt et en sélectionnant Segment Signal. Cela ajoutera une option supplémentaire intitulée Section Zoomed à la case liste de section, correspondant aux points de temps sélectionnés. Les résultats de la segmentation apparaîtront dans la boîte à liste adjacente au signal moyen des tissus, et afficheront le nombre de sections et le CL estimé. Toutes les sections de temps segmentées sont indiquées par différentes couleurs. Sélectionnez un segment de la boîte à liste pour mettre en évidence cette section en rouge. Cela déclenchera également automatiquement des analyses de cette section, comme si le bouton Produce Maps avait été sélectionné (voir la section 5). Des analyses des pics groupés seront effectuées sur les données « moyennes d’ensemble ». Il s’agit de faire la moyenne des pics d’un segment ensemble, les temps de référence étant les pics identifiés à l’étape 4.2. Mettre à jour la fenêtre de temps à la moyenne en modifiant les entrées avant et après et en appuyant sur Le signal de segment. 5. Analyse de la durée transitoire du potentiel d’action/calcium et de la vitesse de conduction Une fois les images traitées, le bouton Produce Maps devient actif. Appuyez sur Produce Maps pour appliquer la durée potentielle d’action (APD), le temps d’activation, la vitesse de conduction et l’analyse SNR. Par défaut, l’analyse sera appliquée au premier segment de signal. Sélectionnez d’autres segments de la liste-boîte appliquera l’analyse au segment choisi.REMARQUE : Les résultats de l’analyse sont affichés dans le tableau des résultats, y compris la moyenne, l’écart type, l’erreur type, la variance et l’analyse du 5e au 95e percentile. Les cartes de durée sont appelées cartes ‘APD’ cependant, les signaux de calcium traités à l’aide des mêmes paramètres mesureront la durée transitoire du calcium. Sélectionnez Obtenez Pixel Info pour voir un affichage détaillé du signal à partir de n’importe quel pixel dans l’image, et Comparez les pixels pour tracer simultanément les signaux à partir de jusqu’à 6 emplacements. Utilisez le panneau de traitement des signaux pour ajuster les paramètres pour l’analyse de la durée. Il s’agit de: Durée – Temps de repolarisation/décroissance en pourcentage pour mesurer à partir du pic; ‘APD’ Baseline – Période de temps du signal qui est définie comme référence de référence pour les mesures de l’amplitude; et ‘APD’ Heure de début – Heure de début pour les mesures de durée. Ce sont les mêmes options pour décider du temps d’activation pour les cartes isochronales (voir ci-dessous) et sont appelés: Démarrer ( d2F/dt2max), Upstroke (dF/dtmax), Depolarisation midpoint (temps d’amplitude de 50%), Pic (temps d’amplitude maximale). Ces définitions appliquées aux potentiels d’action des souris et des cobayes sont présentées à la figure 2A.REMARQUE : La modification de l’une de ces options mettra automatiquement à jour la carte de durée et le tableau des résultats. L’échelle de la carte et des options de suppression aberrantes sont également disponibles. La vitesse de conduction est également mesurée automatiquement dans l’interface logicielle principale. Ceci est réalisé en utilisant la méthode multi-vectorderie de Bayly et al26 à partir de la carte isochronale définie par la mesure d’activation choisie (discutée à l’étape 5.4). Appuyez sur Les points d’activation pour rendre une représentation 3D de la carte d’activation. La méthode de mesure de la vitesse de conduction multivectorielle segmente spatialement la carte isochronale en régions de n x n pixels. Définir la valeur de n à l’aide de l’entrée de taille de fenêtre locale, et définir la plage de temps d’activation pour appliquer l’analyse à l’aide des entrées de temps d’activation de montage.REMARQUE: Pour chaque région locale, une surface polynomiale, f, est équipé qui décrit le mieux la relation entre le temps d’activation et la position spatiale, (x,y). Le vecteur de gradient, CVlocal,de cette surface est alors calculé comme :①où dénote l’opérateur différentiel spatial cartésien bidimensionnel26. Pour chaque pixel de la carte isochronale, un vecteur local représentant la vitesse et la direction de la conduction est calculé. Sélectionnez Carte Isochronal avec des vecteurs du menu de déclassement de l’affichage pour afficher cette analyse. Le RNS est calculé comme le rapport de l’amplitude maximale par rapport à l’écart standard du signal à la ligne de base. Cette analyse est effectuée après toutes les étapes de traitement. Appuyez sur le calcul SNR dans le menu supérieur pour modifier les paramètres de la période du signal définie comme la ligne de base. 6. Module d’analyse de conduction Conduite de presse pour accéder à une analyse plus détaillée de la vitesse de conduction. Cela ouvre un module distinct où la conduction peut être quantifiée en utilisant la méthode multivectorielle Bayly comme dans l’interface principale, les méthodes vectorielles uniques, et comme une courbe d’activation. Appuyez sur Single Vector pour analyser la conduction à l’aide de la méthode vectorielle unique, où le CV est calculé à partir du retard dans le temps d’activation entre deux points. Cela peut être fait en utilisant des méthodes automatiques ou manuelles, sélectionnables sous le bouton Single Vector. Pour la méthode vectorielle unique automatique, sélectionnez une distance et un point de départ à partir duquel mesurer la conduction. Le logiciel effectuera ensuite un balayage à 360 degrés à partir du point choisi, mesurant le délai et calculant la vitesse de conduction associée dans toutes les directions par incréments de 1 degré. Les résultats de cette analyse sont affichés dans le graphique adjacent à la carte, et la direction de la conduction la plus lente est indiquée en rouge. Pour la méthode vectorielle unique manuelle, choisissez à la fois un point de départ et un point d’extrémité à partir de la carte isochronale pour calculer la vitesse de conduction. Pour sélectionner un nouveau point de départ, appuyez sur Clear Start Point. Appuyez sur Local Vector pour appliquer la méthode multi vectorielle, les paramètres correspondant à ceux de l’interface principale. Dans le module de conduction, la répartition des vitesses de conduction, ainsi que la distribution angulaire des vecteurs calculés et la dépendance angulaire de la vitesse de conduction peuvent être affichées. Appuyez sur la courbe d’activation pour tracer le pourcentage de tissu activé en fonction du temps. Le temps d’activation à 100% est automatiquement affiché, tandis que les valeurs personnalisées pour les pourcentages d’activation minimum (bleu) et maximum (rouge) entre lesquels mesurer peuvent également être sélectionnées. 7. Analyses et modules supplémentaires Outre les analyses automatiques de la durée et de la vitesse de conduction, plusieurs autres paramètres peuvent être quantifiés à l’aide d’ElectroMap. Ces analyses sont sélectionnables à partir du menu déroulant au-dessus de la carte d’affichage. Sélectionnez l’une de ces options pour effectuer l’analyse, et les résultats apparaîtront dans la 4e rangée du tableau des résultats : 1) Intervalle diastolique – Temps de 90 % de répolarisation à l’heure d’activation du potentiel d’action suivant ; 2) Fréquence dominante – Le spectre de fréquence de chaque pixel est calculé à l’aide de la transformation rapide de Fourier, et la fréquence avec le plus de puissance est définie comme la fréquence dominante. Des paramètres avancés de portée et de fenêtre pour l’analyse de fréquence dominante sont disponibles en sélectionnant la cartographiede fréquence ; 3) Temps de pointe – Le temps de montée entre deux pourcentages sélectionnés par l’utilisateur (par défaut 10 à 90%) phase de dépolarisation du potentiel d’action ou de la libération de calcium. Les valeurs de pourcentage peuvent être modifiées en sélectionnant les paramètres TTP; et 4) Relaxation constante ()- La constante de relaxation est calculée en adaptant une décomposition mono-exponentielle de la forme :②où le niveau de fluorescence à l’époque t dépend de la fluorescence maximale, F0, et la carie subséquente (C est une constante)27. La valeur entre laquelle s’adapter à l’équation 2 sont sélectionnables dans les interfaces utilisateur electroMap principales, ainsi qu’une bonté de critères d’exclusion d’ajustement basés sur la valeur r 2. Appuyez sur L’analyse des fichiers uniques pour ouvrir un module dédié pour la durée de débit élevé et l’analyse de conduction de chaque segment identifié dans un fichier. L’analyse peut être effectuée soit sur l’ensemble de l’image (durée, conduction et temps d’activation) soit sur des régions ou des points d’intérêt sélectionnés (actuellement durée seulement). Les résultats sont répertories sur un fichier .csv.REMARQUE : Pour les valeurs APD de l’image entière, la première colonne du fichier .csv est la moyenne, tandis que la deuxième colonne est l’écart standard. Appuyez sur Alternans pour lancer un module autonome pour l’analyse dédiée et la cartographie de la variabilité beat-to-beat. Voir O’Shea et coll. 201913 pour plus de détails sur les options de traitement et d’analyse des alternans. Plus précisément, ce module est conçu pour identifier deux oscillations d’époque, connues sous le nom d’alternans. Les alternans de durée et d’amplitude sont calculés et outputted.REMARQUE : Les alternans de durée sont mesurés en comparant la mesure de durée d’un pic à l’autre ; c’est-à-dire si le pic un et deux et APD1 et APD2 respectivement, alors l’alternan de durée (APD) est calculé comme③La mesure de la durée est effectuée à l’aide des paramètres de l’interface principale. Pendant ce temps, les alternans d’amplitude peuvent être quantifiés et cartographiés à travers les préparations multicellulaires comme changement absolu (défini comme un pourcentage où 0% – même amplitude entre un battement et l’autre). En outre, les effets de phénomènes tels que la charge de calcium peuvent être étudiés plus en mesurant et en comparant les alternans de charge et de libération, comme cela a été précédemment rapporté28. Si L est défini comme l’amplitude maximale des grands battements (c.-à-d. où l’amplitudeest plus grande que le battement précédent), S l’amplitude des petits battements, etD la charge diastolique des petits battements, la libération alterne ( ) sont définis comme :④Inversement, les alternans de charge () sont définis comme suit :(5)Les mesures des alternans peuvent être effectuées sur l’ensemble du tissu, et les résultats de l’analyse sont affichés en bas à droite du module. Lors de la première utilisation du module, l’analyse est effectuée sur l’ensemble du fichier expérimental, et les résultats affichés sont une différence moyenne de battement-battement sur l’ensemble du fichier. Toutefois, l’analyse peut être limitée à des heures spécifiques dans le fichier en désélectionnant Hold Zoom, en zoomant sur une période de temps spécifique, et en sélectionnant Analyse Zoomed Section. Cela permettra de mettre à jour le panneau de résultats pour afficher l’analyse de la période de temps sélectionnée. Sélectionnez la lecture pour afficher une vidéo beat-to-beat de l’analyse des alternans. En outre, sélectionnez Créer la carte moyenne pour exporter une carte du comportement des alternans en moyenne à partir des points de temps de sélection, qui sont réglés dans le menu pop-up lors de l’utilisation de cette fonctionnalité. Appuyez sur La carte de phase pour lancer le module de cartographie de phase. Une transformation Hilbert est effectuée pour calculer la phase instantanée (entre – et ‘ ) des signaux à chaque point de temps. Appuyez sur le curseur de lecture ou de glisser pour visualiser le comportement de phase au fil du temps et cliquez sur un pixel pour rendre un diagramme de phase. 8. Données d’exportation Les données sont exportées à partir d’ElectroMap sous diverses formes. Appuyez sur valeurs d’exportation pour enregistrer les valeurs de la carte actuellement affichée dans l’interface principale utilisée. Les valeurs mesurées peuvent être enregistrées sous forme de carte (préservant les emplacements des pixels) ou condensées en une seule liste, et peuvent être enregistrées sous forme de .csv,.txt ou . Fichiers MAT. Appuyez sur La carte d’exportation pour mettre en place un pop-up contenant la carte actuellement affichée, qui peut ensuite être enregistré dans une variété de formats d’image. Les options d’affichage pour la carte sont contrôlées en sélectionnant les paramètres de carte, mais peuvent également être modifiées une fois que la carte export a été sélectionnée. Par exemple, une barre de couleur peut être ajoutée en sélectionnant cette icône dans le menu du haut, et l’échelle peut être fixée en sélectionnant Edit ‘gt; Colormap. Appuyez sur La vidéo d’activation pour rendre une animation de la séquence d’activation, qui peut être enregistrée sous forme de fichier .gif animé. Press Segment Video pour enregistrer un fichier vidéo .avi du paramètre actuellement affiché de chaque segment identifié.