Summary

High-throughput analyse van optische toewijzingsgegevens met behulp van ElectroMap

Published: June 04, 2019
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft de installatie en het gebruik van ElectroMap, een op MATLAB gebaseerd open-source software platform voor de analyse van cardiale optische toewijzingsgegevens. ElectroMap biedt een veelzijdige High-throughput tool voor analyse van optische mapping spanning en calcium datasets over een breed scala van cardiale experimentele modellen.

Abstract

Optische mapping is een gevestigde techniek voor hoge spatio-temporele resolutie studie van cardiale elektrofysiologie in multi-cellulaire preparaten. Hier presenteren we, in een stapsgewijze handleiding, het gebruik van ElectroMap voor analyse, kwantificering en mapping van hoge-resolutie voltage en calcium datasets verkregen door optische mapping. ElectroMap-analyse opties beslaan een breed scala aan belangrijke elektrofysiologische parameters, en de grafische gebruikersinterface maakt eenvoudige wijziging van voor verwerking en parameterdefinities mogelijk, waardoor ElectroMap toepasbaar is op een breed scala van experimentele modellen. We laten zien hoe ingebouwde pacing frequentie detectie en signaal segmentatie een high-throughput analyse van volledige experimentele opnames, acute reacties en één Beat-to-beat variabiliteit mogelijk maakt. Daarnaast bevat ElectroMap geautomatiseerde multi-beat gemiddelden om de signaalkwaliteit van lawaaierige gegevenssets te verbeteren, en hier laten we zien hoe deze functie kan helpen om elektrofysiologische veranderingen te verhelderen die anders onopgemerkt zouden kunnen blijven bij het gebruik van single Beat-analyse. Aangepaste modules zijn opgenomen in de software voor gedetailleerd onderzoek van de geleiding, analyse van één bestand, en plaatsvervankers, zoals hier gedemonstreerd. Dit software platform kan worden gebruikt om de verwerking, analyse en mapping van complexe cardiale elektrofysiologie in te schakelen en te versnellen.

Introduction

Optische mapping maakt gebruik van fluorescerende verslaggevers van spanning en/of calciumconcentratie voor het ondervragen van cardiale elektrofysiologie (EP) en de behandeling van calcium in multicellulaire preparaten, met een grotere ruimtelijke resolutie dan haalbaar met traditionele technieken1,2,3. Daarom is optische mapping ontstaan als een belangrijke en steeds vaker gebruikte techniek, die belangrijke inzichten verschaft in fysiologisch en pathofysiologisch elektrisch gedrag in het hart3,4,5 ,6,7,8. Een effectieve verwerking en analyse van gegevens die zijn verkregen uit experimenten met optische toewijzingen, wordt bemoeilijkt door verschillende factoren. De hoge spatiotemporele resolutie aard van optische kaartgegevens sets resulteert in RAW-videobestanden die bestaan uit duizenden afbeeldingskaders, elk opgebouwd uit een aantal afzonderlijke pixels, waardoor grote gegevensbestanden ontstaan die een hoge doorvoer vereisen en geautomatiseerde verwerking9. Kleine pixel groottes, slecht en ongelijkmatig laden van de kleurstof en kleine fractionele veranderingen in fluorescentie resulteren in optische signalen met een lage signaal-ruis verhouding (SRV), die voor bewerking voorafgaand aan een effectieve analyse haalbaar is10. Verwerking en analyse kunnen verder worden bemoeilijkt door het gebruik van optogenetische pacing-protocollen die licht gebruiken om activering te initiëren, waardoor het opgenomen signaal van de fluorescentie sensoren11,12mogelijk wordt verstoord. Bovendien kunnen, zodra gegevens zijn verwerkt, verschillende niet-consistente technieken en definities worden toegepast om parameters van belang te meten, waarbij de meest toepasselijke technieken variëren, afhankelijk van de experimentele opzet, het model en de vraag2, 10,13. Deze beperkingen verhinderen verdere opname van de technologie en belemmeren een echte objectieve analyse.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben verschillende onderzoeksgroepen aangepaste verwerkings pijpleidingen ontworpen die zijn afgestemd op hun experimentele model, vraag en hardware7,14,15,16. Anderen maken gebruik van commerciële propriëtaire software waarbij de onderliggende algoritmen moeilijk toegang kunnen hebben tot4,17. Als gevolg hiervan is er een duidelijke behoefte aan een vrij beschikbaar open-source software platform voor de verwerking en analyse van optische toewijzingsgegevens. Het is belangrijk dat deze software open-source, makkelijk te gebruiken, flexibel tot parameter aanpassing is, toepasbaar op een reeks experimentele modellen met verschillende EP-eigenschappen en een cruciale mogelijkheid biedt om eenvoudige en instelbare kwantificering van het bereik van cardiale parameters die kunnen worden bestudeerd met behulp van optische toewijzing.

We hebben onlangs een uitgebreid software platform, ElectroMap, gepubliceerd en uitgebracht voor High-through, semi-geautomatiseerde verwerking, analyse en mapping van cardiale optische mapping datasets13. Hier presenteren we een video handleiding voor het gebruik van ElectroMap en demonstreren hoe het kan worden gebruikt voor het verwerken, analyseren en toewijzen van verschillende optische mapping datasets. We richten ons op het gebruik van ElectroMap om standaard EP-en calcium behandelings variabelen te kwantificeren en het gebruik van standalone geleidings snelheid, analyse van één bestand en alteren tie-modules aan te tonen.

Protocol

1. verzameling van optische toewijzingsgegevens Cardiale optische mapping uitvoeren met behulp van een van een breed scala van experimentele modellen, met inbegrip van intact en geïsoleerde hele harten6,18, geïsoleerde atria14,19, ventriculaire wiggen20, hart schijfjes 21 , 22, en cellulaire monolagen23. Zie de bijbehorende verwijzingen naar experimentele ontwerpen voor het verzamelen van onbewerkte optische toewijzingsgegevens van deze preparaten. Op voorwaarde dat de verkregen gegevens kunnen worden geconverteerd naar een TIFF-stapel of worden opgeslagen in een. MAT-bestand, moet het worden analyseerbaar met behulp van ElectroMap. Dit omvat gegevens van verschillende afmetingen (vierkant/rechthoekig) en resoluties (maximaal getest op dit moment 2048 pixels x 2048 pixels). 2. software installeren en opstarten Opmerking: Hieronder vindt u gedetailleerde de twee methoden voor het installeren en uitvoeren van ElectroMap-hetzij binnen MATLAB uitvoeren vanaf de bron (. m) code of als een standalone uitvoerbaar bestand (. exe voor Windows). De uiteindelijke software en de functionaliteit ervan zijn invariant tussen de twee Setup-opties (anders dan een paar verschillen in de Directory navigatie). Daarom zijn de belangrijkste overwegingen voor het kiezen van de versie te installeren toegang tot MATLAB en vereiste gereedschapskisten en of toegang tot broncode gewenst is. Waar mogelijk wordt aanbevolen om de MATLAB-versie te gebruiken voor snellere opstarttijden, Kortere verwerkingstijden en eenvoudigere foutrapportage. Installatie 1: electromap uitvoeren binnen MATLAB Installeer MATLAB. ElectroMap is ontworpen in MATLAB 2017a, maar software is getest voor gebruik in alle volgende releases van MATLAB (tot 2018b op het moment van schrijven). De volgende gereedschapskisten zijn vereist: beeldverwerking, signaalverwerking, statistiek en machine learning, en fitting van de curve. Download/kloon alle bestanden van de nieuwste ‘ source code ‘ release van electromap uit de GitHub repository (https://github.com/CXO531/ElectroMap). Unzip de gedownloade inhoud naar een gewenste locatie. Open MATLAB en navigeer naar de maplocatie die de broncode van de elektro kaart host. Open vervolgens het bestand electromap. m en druk op run in de editor, of typ ook electromap in het opdrachtvenster en druk op return. Hiermee start u de ElectroMap-gebruikersinterface, Figuur 1a. Setup 2: zelfstandig. exe-bestand Download het installatiebestand: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI. Volg de instructies in het installatieprogramma, die zal downloaden vereist de MATLAB-runtime van het web naast ElectroMap software. Voer Electromap. exeuit.Opmerking: opstarttijd voor de zelfstandige versie kan enkele minuten duren. 3. afbeelding laden en voorbewerken Druk op Selecteer map en navigeer naar de locatie van het te analyseren gegevensbestand (en). Hiermee vult u de linker ListBox met alle bestanden in die map die van het juiste bestandstype zijn (. TIF of. MAT). . MAT-bestanden mogen alleen de afbeeldings stack variabele bevatten.Opmerking: alleen mappen en geen afzonderlijke bestanden worden weergegeven wanneer u door de Mapkiezer navigeert. Selecteer bestand dat vanuit de interface moet worden geladen en druk op afbeeldingen laden. Eenmaal geladen, zal het eerste frame verschijnen en de rode omtrek geeft de automatische drempel van de afbeelding aan. Indien nodig, reload eerder gebruikte ROIs door te selecteren Opslaan/load ROI. In dit geval slaat u stap 3,3 over. Standaard is drempelmethode gebaseerd op de pixel intensiteiten in het eerste frame. Wijzig indien gewenst de drempelwaarde op basis van de amplitude van de signaal tijd cursus door de optie in het dropdown-menu afbeelding voor drempel te wijzigen. Let op: zodra de drempel is geselecteerd, wordt deze vervolgens toegepast voor de hele afbeeldingsstapel. Wijzig desgewenst de optie drempel in handmatig, waarmee de schuifregelaar wordt geactiveerd om de afbeeldings drempel handmatig aan te passen. Bovendien, bijsnijden van afbeeldingen (afbeelding bijsnijden) en/of teken een aangepaste regio van belang (aangepaste ROI) voor analyse door het selecteren van de juiste selectievakje (sen) onder drempel opties. Houd er rekening mee dat geavanceerde opties voor de regio van interesse selectie, zoals het aantal gebieden zijn beschikbaar via ROI selectie in het bovenste menu. Zodra een geschikte drempel is toegepast, drukt u op proces afbeeldingen om de verwerking toe te passen. Instellingen voor verwerking worden hieronder beschreven (stap 3.4.1-3.4.5). Zorg er op dit moment voor dat de juiste camera-instellingen zijn ingevoerd. Dit zijn de pixelgrootte in ΜM (belangrijk: dit is de pixelgrootte van de afbeelding en niet de grootte van de pixels die de chip of equivalente hardware in het imaging-apparaat vormen) en framerate in kHz. Vink voor signaal inversie het selectievakje gegevens omkeren aan om in te schakelen. Indien gerapporteerd fluorescerende signaal omgekeerd evenredig aan parameter van belang (zoals met veelgebruikte potentiometrische kleurstoffen) het signaal kan worden omgekeerd. Voor ruimtelijke filtering selecteert u Gaussian of Average in het kernelmenu. De grootte van het spatiaal gemiddelde gebied wordt bepaald door de grootte -ingang naast het vervolgkeuzemenu van de kernel (d.w.z. 3 resulteert in een filter kernel van 3 pixel x 3 pixels). Bij het aanbrengen van een Gaussiaanse filter kan de standaarddeviatie ook worden ingesteld vanuit de Sigma -ingang. Voor correctie op basislijn, selecteer Top-Hat24 of polynomiale (4th of 11th graden) correctie25 in het menu basislijn . Correctie kan worden toegepast op elke pixel afzonderlijk (lange verwerkingstijd) of als een gemiddelde van de gehele afbeelding (sneller, maar veronderstelt homogene Baseline wijzigingen). Top-Hat correctie kan ook worden gewijzigd door het instellen van de lengte van de Top-Hat in milliseconden, grenzend aan de basislijn selectie vervolgkeuzemenu. De lengte van de Top-Hat kernel moet groter zijn dan de tijdschaal van de individuele actie potentials/calcium transients. Voor tijdelijke filtering selecteert u Savitzky-Goaly of Infinite Impulse (IIR) filtering in het filter menu.Opmerking: anders dan voor het gemiddelde weefsel signaal dat linksonder wordt weergegeven, wordt tijdelijke filtering toegepast op elke pixel afzonderlijk op het moment dat de parameter kwantificering van de gemiddelde afbeeldingsreeksen van het ensemble wordt gebruikt. Dit is geïmplementeerd om de verwerkingstijd te verkorten door kleine gedeelten van gegevens te filteren wanneer dat nodig is in plaats van hele bestanden. Houd er bij het verwijderen van frames rekening mee dat als de optie kaders verwijderen is geselecteerd, grote pieken met een amplitude groter dan het signaal van belang kunnen worden verwijderd uit de afbeeldingsset. Dit kan nuttig zijn in optisch tempogegevens sets zoals optogenetische pacing waar depolarisatie wordt geïnitieerd door optische activering van opsins zoals channelrhodopsin 211,12.Opmerking: als het frame verwijderen zal mogelijk leiden tot onfysiologische stap wijzigingen in de beeldsignalen, temporele filtering kan artefacten introduceren om de gegevens en dus wordt hier niet aanbevolen. Merk op dat het signaal wordt gesegmenteerd zodra de proces afbeeldingen zijn geselecteerd op basis van de opties onder segmentatie opties, maar dit kan snel worden gewijzigd zonder de volledige gegevensset opnieuw te verwerken (zie sectie 4). 4. data segmentatie en ensemble middeling Opmerking: zodra het bestand is verwerkt, zullen pieken in het gemiddelde signaal van het weefsel (rechtsonder traceren, Figuur 1a) zijn gedetecteerd en geëtiketteerd door rode cirkels. Alleen pieken boven een ingestelde drempelwaarde (blauwe lijn op trace die is ingesteld met piek drempelwaarde) worden geteld. Bovendien worden pieken alleen geteld als ze voldoende vertraagd zijn in vergelijking met de vorige pieken, ingesteld door de min piek afstand ingang. Signaal wordt vervolgens gesegmenteerd op basis van de gedetecteerde pieken. Ten eerste wordt de effectieve cyclus lengte (CL) van elke piek berekend door het meten van de tijd ertussen en de volgende piek. Als een aantal pieken (ingesteld door Min aantal pieken input) vergelijkbare CLs (drempelwaarde die is ingesteld door de minimale grens ingang) dan zijn ze gegroepeerd en de gemiddelde cl voor die pieken berekend. Druk op segment signaalvoor verdere segmentatie van de gegevens. Opties voor sub-segmentatie zijn: geen – alle pieken met dezelfde cl gegroepeerd; Alle – segmenten van npieken binnen de constante cl tijden (npieken wordt bepaald door de segment grootte input) worden geïdentificeerd; Laatste – laatste nPIEKEN voordat een cl verandering worden geïdentificeerd en gegroepeerd, en alle andere worden niet geanalyseerd; en Single beat -dit is gelijk aan het toepassen van de alle segmentatie met npieken = 1, en dus geen groepering of ensemble middeling (zie 4,5) worden toegepast. Dit kan worden toegepast door het selecteren van de Single beat knop. Pas aangepaste segmentatie van het signaal toe door in te zoomen op een tijd van interesse en segment signaalte selecteren. Hiermee voegt u een extra optie met de titel ingezoomde sectie toe aan de keuzelijst sectie, die overeenkomt met de geselecteerde tijdspunten. De resultaten van de segmentatie zullen verschijnen in de lijst-Box grenzend aan het weefsel gemiddelde signaal, en zal tonen sectienummer en de geschatte CL. Alle gesegmenteerde tijd secties worden aangeduid met verschillende kleuren. Selecteer een segment in de keuzelijst om die sectie in het rood te markeren. Dit zal ook automatisch leiden tot analyses van deze sectie, alsof de knop kaarten produceren is geselecteerd (zie rubriek 5). Analyses van gegroepeerde pieken zullen worden uitgevoerd op de ‘ ensemble middelaged ‘ gegevens. Dit betekent dat de pieken in een segment samen worden berekend, waarbij de referentie tijden de pieken zijn die in stap 4,2 zijn geïdentificeerd. Werk het tijdvenster bij tot het gemiddelde door de ingangen voor en na te wijzigen en op segment signaalte drukken. 5. actiepotentiaal/calcium voorbijgaande duur en geleiding Velocity analyse Zodra de afbeeldingen zijn verwerkt, wordt de knop ‘ Produceer Maps ‘ actief. Druk op produce Maps om actiepotentiaal duur (apd), activeringstijd, geleidings snelheid en SNR-analyse toe te passen. Standaard wordt de analyse toegepast op het eerste signaal segment. Selecteer andere segmenten in de lijst-box zal analyse toepassen op gekozen segment.Opmerking: resultaten van de analyse worden weergegeven in de resultatentabel, met inbegrip van gemiddelde, standaarddeviatie, standaardfout, variantie en 5e tot en met 95e percentiel analyse. Duur kaarten worden ‘ APD ‘ kaarten genoemd echter, calcium signalen verwerkt met behulp van dezelfde instellingen zal calcium voorbijgaande duur meten. Selecteer pixel info ophalen om een gedetailleerde weergave van het signaal van een willekeurige pixel in de afbeelding te zien en vergelijk pixels om tegelijkertijd signalen van maximaal 6 locaties te tekenen. Gebruik het paneel signaalverwerking om instellingen voor duur analyse aan te passen. Dit zijn: duur – tijd van percentage repolarisatie/verval op maat van piek; ‘ Apd ‘ baseline – tijdsperiode van signaal dat is gedefinieerd als referentie basislijn voor amplitude metingen; en ‘ apd ‘ starttijd – starttijd voor duur metingen. Dit zijn dezelfde opties voor het bepalen van de activeringstijd voor isochronal-kaarten (hieronder besproken) en worden aangeduid als: start (d2F/DT2Max), upstroke (DF/DTMax), depolarisatie middelpunt (tijd van 50% amplitude), piek (tijd van maximale amplitude). Deze definities voor muis-en cavia-actie potentialen worden weergegeven in Figuur 2a.Opmerking: als u een van deze opties wijzigt, worden de duur kaart en de resultatentabel automatisch bijgewerkt. Kaartschaal en uitschieter verwijderingsopties zijn ook beschikbaar. Conductie snelheid wordt ook automatisch gemeten binnen de HoofdSoftware-interface. Dit wordt bereikt met behulp van de multi-vector methode van Bayly et al26 van de isochronal-kaart die is gedefinieerd door de gekozen activerings maatregel (besproken in stap 5,4). Druk op activerings punten om een 3D-weergave van de activerings kaart te genereren. De multi-vector geleidings snelheid meetmethode segmenteert de isochronal-kaart ruimtelijk in gebieden van n x n pixels. Stel de waarde van n in met de invoer van het lokale vensterformaat en stel het bereik van de activeringstijden in om de analyse toe te passen op de invoer van de aanpassings tijden .Opmerking: voor elke lokale regio is een veelterm oppervlak, f, gemonteerd dat het beste de relatie beschrijft tussen activeringstijd en ruimtelijke positie, (x,y). De gradiënt Vector ,lokaalCV, van dit oppervlak wordt vervolgens als volgt berekend:1waarbij de tweedimensionale Cartesische ruimtelijke differentiaaloperator26wordt aangeduid. Voor elke pixel in de isochronal-map wordt een lokale vector berekend die de snelheid en richting van de geleiding weergeeft. Selecteer isochronal-kaart met vectoren in het dropdown-menu weergeven om deze analyse te bekijken. SNR wordt berekend als de verhouding van de maximale amplitude ten opzichte van de standaarddeviatie van het signaal bij Baseline. Deze analyse wordt uitgevoerd na alle verwerkingsstappen. Druk op de SNR-berekening in het bovenste menu om instellingen te bewerken voor de periode van het signaal dat als basislijn is gedefinieerd. 6. geleidings analyse module Pers geleiding voor toegang tot een gedetailleerdere analyse van de geleidings snelheid. Dit opent een aparte module waar de geleiding kan worden gekwantificeerd met behulp van de Bayly multi-vector methode zoals in de Hoofdinterface, enkele vector methoden, en als een activerings curve. Druk op enkele vector om de geleiding te analyseren met behulp van de enkele vector methode, waarbij CV wordt berekend op basis van de vertraging in de activeringstijd tussen twee punten. Dit kan worden gedaan met behulp van automatische of handmatige methoden, selecteerbaar onder de enkele vector knop. Voor automatische enkelvoudige Vector methode selecteert u een afstand en startpunt voor het meten van de geleiding. De software voert vervolgens een sweep van 360 graden uit vanaf het geselecteerde punt, waarbij de tijdsvertraging wordt gemeten en de bijbehorende geleidings snelheid langs alle richtingen in stappen van 1 graden wordt berekend. De resultaten van deze analyse worden weergegeven in de grafiek naast de kaart en de richting van de traagste geleiding wordt rood weergegeven. Voorhand matige enkelvoudige Vector methode kiest u zowel een start-als een eindpunt van de isochronal-kaart om de geleidings snelheid te berekenen. Als u een nieuw startpunt wilt selecteren, drukt u op Clear start Point. Druk op lokale vector om de multi vector-methode toe te passen, met de instellingen die overeenkomen met die van de Hoofdinterface. Binnen de geleidings module kan de verdeling van geleidings snelheden, evenals de hoekige verdeling van berekende vectoren en hoek afhankelijkheid van geleidings snelheid worden weergegeven. Druk op activerings curve om het percentage van het weefsel dat als functie van de tijd is geactiveerd, te tekenen. Tijd tot 100% activering wordt automatisch weergegeven, terwijl aangepaste waarden voor minimale (blauwe) en maximale (rode) activerings percentages waartussen te meten ook kunnen worden geselecteerd. 7. aanvullende analyses en modules Afgezien van de automatisch uitgevoerde duur en geleidings snelheid analyses, kunnen verschillende andere parameters worden gekwantificeerd met behulp van ElectroMap. Deze analyses zijn selecteerbaar in het dropdown menu boven de display kaart. Selecteer een van deze opties om de analyse uit te voeren en de resultaten worden weergegeven in de 4e rij van de resultatentabel: 1) diastolische interval – tijd van 90% repolarisatie naar activeringstijd van de volgende actiepotentiaal; 2) dominante frequentie – frequentiespectrum van elke pixel wordt berekend met behulp van de snelle Fourier-transformatie, en de frequentie met de meeste macht wordt gedefinieerd als de dominante frequentie. Geavanceerde bereik-en venster instellingen voor een dominante frequentie analyse zijn beschikbaar door het selecteren van frequentietoewijzing; 3) time to Peak – de stijgtijd tussen twee door de gebruiker geselecteerde percentages (standaard 10 tot 90%) van de depolarisatie fase van het actiepotentiaal of het vrijkomen van calcium. Percentage waarden kunnen worden gewijzigd door TTP-instellingente selecteren; en 4) ontspannings constante (τ) – ontspannings constante wordt berekend door een mono-exponentieel verval van de vorm van de vorm te monteren:2Wanneer het fluorescentie niveau op tijd t afhangt van de piek fluorescentie, F0, en het daaropvolgende verval (C is een constante)27. De waarde die moet worden aangepast aan vergelijking 2, is selecteerbaar binnen de Hoofdgebruikers interfaces van de elektro kaart, evenals een goedheid van de uitsluitingscriteria voor passen op basis van de r2 -waarde. Druk op analyse van één bestand om een speciale module te openen voor een hoge doorvoer duur en een geleidings analyse van elk geïdentificeerd segment in een bestand. Analyse kan worden uitgevoerd op de hele afbeelding (duur, geleiding en activeringstijd) of op geselecteerde regio’s of nuttige punten (momenteel alleen duur). Resultaten worden gegenereerd naar een CSV-bestand.Opmerking: voor APD-waarden uit de hele afbeelding is de eerste kolom in het CSV-bestand het gemiddelde, terwijl de tweede kolom de standaarddeviatie is. Druk op Alterzen om een standalone module te initiëren voor specifieke analyse en mapping van Beat-to-beat variabiliteit. Zie O’Shea et al. 201913 voor meer informatie over alternatieven voor verwerking en analyse. Specifiek, deze module is ontworpen om te identificeren twee periode oscillaties, bekend als plaatsvervankers. Zowel de duur als de amplitude afwisselend worden berekend en gegenereerd.Opmerking: duur vervangen worden gemeten door de duur meting te vergelijken van de ene piek naar de volgende; d.w.z. als respectievelijk piek één en twee en APD1 en apd2 , dan wordt de duur alternan (δapd) berekend als3De duur meting wordt uitgevoerd met behulp van de instellingen in de Hoofdinterface. Ondertussen kunnen amplitude-alternatieven worden gekwantificeerd en in kaart gebracht over multi-cellulaire preparaten als absolute verandering (gedefinieerd als een percentage waarbij 0% = dezelfde amplitude tussen één beat en de volgende). Bovendien kunnen de effecten van verschijnselen zoals calcium belasting verder worden onderzocht door het meten en vergelijken van belasting en vrijgekomen plaatsvervankers, zoals eerder gemeld28. Als L wordt gedefinieerd als de piek amplitude van de grote beats (d.w.z. waar de amplitude groter is dan de vorige Beat), S de amplitude van de kleine beats, enD de diastolische belasting van de kleine beats, de release alterzen ( ) worden gedefinieerd als:4Omgekeerd worden belasting vervankers () gedefinieerd als:5Plaatsvervankers kunnen worden gemeten over het hele weefsel en de resultaten van de analyse worden rechtsonder in de module weergegeven. Wanneer u de module voor het eerst gebruikt, wordt de analyse uitgevoerd over het hele experimentele bestand en de weergegeven resultaten zijn een gemiddeld Beat-Beat verschil over het hele bestand. De analyse kan echter worden beperkt tot specifieke tijden in het bestand door het selecteren van de Hold-zoom, het inzoomen op een bepaalde periode en het selecteren van de uitgezoomde sectie. Hiermee wordt het deelvenster resultaten bijgewerkt om de analyse van de geselecteerde periode weer te geven. Selecteer afspelen om een beat-to-beat video van de alternatieven analyse weer te geven. Selecteer bovendien maken mean-kaart om een kaart van het alternatieven gedrag te exporteren vanaf de tijdpunten selecteren, die zijn ingesteld in het pop-upmenu wanneer u deze functie gebruikt. Druk op Phase map om de fase mapping module te starten. Een Hilbert-transformatie wordt uitgevoerd om de momentane fase (tussen-π en + π) van de signalen op elk tijdpunt te berekenen. Druk op de schuifregelaar afspelen of slepen om fase gedrag na verloop van tijd te visualiseren en klik op een pixel om een fase diagram weer te geven. 8. gegevens exporteren Gegevens worden geëxporteerd vanuit ElectroMap in verschillende vormen. Druk op export waarden om de waarden van de momenteel weergegeven kaart op te slaan in de hoofdgebruikte interface. Gemeten waarden kunnen worden opgeslagen als een kaart (behoud van pixel locaties) of gecondenseerd in een enkele lijst en kunnen worden opgeslagen als. CSV,. txt of. MAT bestanden. Druk op export map om een pop-up met de momenteel weergegeven kaart te brengen, die vervolgens kan worden opgeslagen in een verscheidenheid aan afbeeldingsformaten. Weergaveopties voor de kaart worden bestuurd door kaartinstellingen te selecteren, maar kunnen ook worden bewerkt nadat de export kaart is geselecteerd. U bijvoorbeeld een kleurenbalk toevoegen door dit pictogram in het bovenste menu te selecteren en de schaal kan worden ingesteld door > Colormap bewerken te selecteren. Druk op activerings video om een animatie van de activerings reeks weer te geven, die kan worden opgeslagen als een geanimeerd. GIF-bestand. Druk op segment video om een AVI-videobestand op te slaan van de momenteel weergegeven parameter van elk geïdentificeerd segment.

Representative Results

Alle werkzaamheden die in het kader van deze studie zijn verricht, zijn uitgevoerd in overeenstemming met ethische richtsnoeren die zijn vastgesteld door de Britse dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986 en richtlijn 2010/63/EU van het EuropeesParlement inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Experimenten werden goedgekeurd door de Home Office (muis: PPL 30/2967 en PFDAAF77F, Guinea Pig: PPL PF75E5F7F) en de institutionele Review boards aan de Universiteit van Birmingham (Mouse) en King’s College Londen (cavia). Gedetailleerde methoden voor het verzamelen van de onbewerkte gegevens die hier zijn geanalyseerd, u vinden in onze vorige publicaties5,6,14,19. De hoofdinterface van waaruit ElectroMap wordt bestuurd, wordt weergegeven in Figuur 1a. De benodigde stappen voor het analyseren van een gegevensset worden voornamelijk beheerd door de knoppen afbeeldingen laden, proces afbeeldingenen kaarten produceren , en worden gemarkeerd in groen, blauw en rood, respectievelijk in Figuur 1a. Afbeelding 1B-D toont de bewerkingen die plaatsvinden op de selectie van elk van deze knoppen. Laden afbeeldingen past de afbeelding drempel opties zoals geselecteerd door de gebruiker (afbeelding 1B), terwijl de proces afbeeldingen (afbeelding 1c) van toepassing filtering en basislijn correctie. Tot slot, produceren Maps zal eerst gemiddelde gegevens volgens de tijdvenster en segmentatie-instellingen (tenzij single beat segmentatie is gekozen) en voer vervolgens analyses hierboven beschreven. Een belangrijk aspect van Electro map is de flexibiliteit met betrekking tot het cameratype en het experimentele model. Dit is cruciaal voor het nut van een optische mapping software als gevolg van de verschillende cardiale EP en anatomische kenmerken die bestaan tussen veel gebruikte modellen. Figuur 2a toont bijvoorbeeld de actiepotentiaal morfologie van de muriene atria in vergelijking met het cavia ventrikel, opgenomen met behulp van spannings gevoelige kleurstoffen zoals eerder gemeld6,14. Ondanks de duidelijke vorm van het actiepotentiaal, en het gebruik van twee aparte optische mapping camera’s met verschillende framerates en pixel groottes, kan Electro map worden gebruikt om beide datasets met succes te analyseren. Dit vereist echter een wijziging van bepaalde parameters binnen de gebruikersinterface (Figuur 2b). Merk op dat het langdurige cavia-actie potentieel een groter tijdvenster vereist. Bovendien, om te voorkomen dat de Top-Hat basislijn correctie de optisch vastgelegde signalen onfysiologisch aanpast, moet de tijdsduur ervan worden verhoogd zodat deze groter is dan het tijdsverloop van het actie potentieel. ElectroMap biedt een veelheid aan verwerkingsopties om de SNR te helpen verbeteren van optisch geregistreerde signalen die nodig kunnen zijn om de EP-parameters effectief te herstellen. Een voorbeeld is geautomatiseerde ensemble middeling van pieken na gegevens segmentatie. Figuur 3a-C demonstreert hoe de toepassing van het ensemble middeling, in plaats van andere methoden, SNR kan verbeteren van geïsoleerde Murine die atria verliet (n = 13). Dit vermindert de meet heterogeniteit en de waarschijnlijkheid van analyse fouten (figuur 3D). Een wijziging van de tempo frequentie van 3 Hz tot 10 Hz heeft bijvoorbeeld geen invloed op APD50, wanneer geen ensemble gemiddelden worden genomen, maar er werd een verwachte29 afname in apd50 bij 10 Hz pacing waargenomen wanneer gemeten uit de gemiddelde gegevens van het ensemble ( Figuur 3E). Figuur 4 demonstreert de werkzaamheid en het nut van geautomatiseerde pacing frequentie detectie en segmentatie aangeboden door electromap. Hier, muis links atria (n = 5) waren tempo op een 120 MS cyclus lengte en cyclus lengte werd stapsgewijs verkort door 10 MS totdat 50 MS. ElectroMap identificeerde automatisch de lengte van de pacing cyclus en gegroepeerde weefsel gemiddelden (figuur 4a ). Dit werd bereikt met een hoge nauwkeurigheid in alle datasets (figuur 4b). Geautomatiseerde segmentatie van de gegevens toegestaan eenvoudige en hoge doorvoer analyse van de vertraging van de geleidings snelheid met verhoogde pacing frequentie/verkorte cyclus lengte (figuur 4c, D). Gelijktijdig, APD50 (figuur 4e) en diastolische interval (figuur 4F) verkort. De amplitude van de optisch gemeten pieken daalde, terwijl de tijd tot piek steeg (figuur 4G, H). Deze zijn opnieuw de verwachte restitutie reacties in hartweefsel29,30 en gebruik van electromap kan helpen daarom verhelde veranderingen in reactie op pacing frequentie in aanwezigheid van farmacologische agentia, genetische modificatie, of ziektetoestanden. Een belangrijke overweging bij het gebruik van een software zoals ElectroMap is de aanwezigheid van artefacten in de onderliggende gegevens. Figuur 5toont bijvoorbeeld aan dat bewegings artefacten (de vervorming van het optisch opgenomen signaal door weefsel beweging) nauwkeurige metingen van activering en vooral repolarisatie binnen electromap kunnen uitsluiten. Zie discussie voor verdere overwegingen. Figuur 1: ElectroMap belangrijkste verwerkingsstappen. (A) grafische gebruikersinterface van electromap, met de Load images (groen), process images (blauw) en Produceer Maps (rood) knoppen gemarkeerd. (B) afbeelding drempel opties die kunnen worden toegepast op het selecteren van afbeeldingen laden. (C) beschikbare signaal verwerkingsopties voor de gebruiker zijn ruimtelijke en temporele filtering en basislijn correctie en kunnen worden toegepast op de afbeeldingsstapel door op proces afbeeldingente drukken. D) de Middelings-en parameter kwantificering van het ensemble (Zie apd-meting) die wordt geactiveerd door kaarten makente selecteren. Figuur aangepast van O’Shea et al., 201913. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: analyse van gegevens van de muis en het cavia met behulp van ElectroMap. A) optisch opgenomen actie potentieel van muizen atria en cavia ventrikels, samen met zowel de eerste (DF/DT) en tweede (d2f/DT2) afgeleide van deze signalen. De verschillende definities voor activatie en repolarisatie tijden inzetbaar binnen elektro kaart zijn gemarkeerd. (B) screenshots van beeld-en signaal Verwerkingsinstellingen gebruikt in de electromaps-interface. Rode dozen accentueren instellingen die vereiste wijziging tussen de analyses van de gegevens van de muis en cavia. Figuur aangepast van O’Shea et al., 201913. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Ensemble middeling om APD-veranderingen op te lossen. (A) apd50 kaart en voorbeeld single pixel signaal van single beat optische actie potentials. (B) apd50 kaart en voorbeeld enkele pixel signaal van optische actie potentialen gegenereerd door Ensemble gemiddelde van 10 opeenvolgende beats (piek methode). (C) SNR van een enkele beat in vergelijking met 10 beat middelverouderde signalen. (D) apd50 heterogeniteit (i) en aantal meetfouten (II) als functie van SNR voor single beat en 10 beat gemiddeld apd50 kaarten. E) apd50 bij een pacing frequentie van 3 en 10 Hz, gemeten vanaf een enkele beat en 10 beat kaarten. (Gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaardfout, n = 13 links atria, * * * *p < 0,001 door de gekoppelde t-toets van de student). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: gebruik van ElectroMap om pacing frequentie responsen in hartweefsel te bestuderen. (A) voorbeeld electromap screenshot van pacing frequentie herkenning en segmentatie. B) vergelijking van bekende en electromap gemeten pacing cyclus lengtes. (C) activerings kaarten op 120 ms en 60 MS pacing cyclus lengtes. (D-H) Gegroepeerde gegevens van geleidings snelheid (d), apd50 (E), diastolische interval (F), amplitude (G) en tijd tot piek (H) als functie van de tempo cyclus lengte die daalt van 120 MS tot 60 MS in stappen van 10 MS. (Gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaardfout, n = 5 linker atria) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: effect van bewegings artefacten. (A) apd50 -kaart. (B) activatie kaart. (C) voorbeeldsignalen van locaties die zijn gemarkeerd (kruisingen) op apd-en activerings kaarten. In het gebied van het weefsel gemarkeerd met het Rode Kruis, contractie is niet succesvol ontkoppeld, verstoren van het gemeten optische signaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Hier presenteren we een stapsgewijze handleiding voor het gebruik van open-source software ElectroMap voor flexibele en multi-variabele analyse van cardiale optische mapping datasets. Voor een succesvol gebruik van ElectroMap, moeten Imaging gegevens worden in. TIF of. MAT formaten. ElectroMap bevat verschillende aanpasbare gebruikersinstellingen. Zoals blijkt uit Figuur 2a, is dit noodzakelijk vanwege de grote heterogeniteit die bestaat tussen experimentele modellen en beeldbewerkings hardware. Dit betekent echter dat de standaardinstellingen binnen de software niet altijd optimaal zijn, dus een cruciale stap in het gebruik van de software is voor de gebruiker om instellingen voor hun specifieke experimentele Setup af te stemmen. Deze omvatten camera-instellingen en tijdschema’s, zoals weergegeven in Figuur 2b. Zodra optimale instellingen zijn gevonden, kunnen deze op latere tijdstippen worden opgeslagen en opnieuw geladen door configuratiebestandte selecteren.

De integratie van geautomatiseerde CL-meting en signaal segmentatie zijn de belangrijkste voordelen van de software. Deze functies maken analyse van acute reacties in experimentele opnames mogelijk en verbreden de analyse van het focussen op geïsoleerde single beats. Zodra de gewenste segmentatie is bereikt, maakt de enkele bestandsanalyse module geautomatiseerde analyse van elk afzonderlijk segment (inclusief single beats), het realiseren van een high-throughput analyse van meerdere variabelen over de opname in een enkelvoudig CSV-bestand. In combinatie is ensemble middeling van gegroepeerde pieken een effectieve methode om de kwaliteit van lawaaierige signalen te verbeteren die automatisch wordt uitgevoerd in ElectroMap. Het gemiddelde van het ensemble is echter niet alomtegenwoordig, bijvoorbeeld in studies naar een beat-to-beat variabiliteit. Daarom integreert Electro map single beat segmentatie om te voorkomen dat ensemble middelaging, alternatieve verwerkingsopties om SNR (ruimtelijke en temporele filtering) te verbeteren en bevat de alternatieven analyse module om verder te onderzoeken en kaart Beat-to-beat variabiliteit.

Gegevenssets voor optische toewijzingen vertonen vaak artefacten zoals basislijn drift en bewegings artefacten. Evenzo kunnen de gegenereerde signalen een lage kwaliteit hebben door kleine pixel groottes, korte belichtingstijden en lage fractionele fluorescerende veranderingen2. Deze factoren voorkomen een effectieve en accurate analyse van het onderliggende EP-gedrag. Zoals geschetst, ElectroMap heeft verschillende verwerkings strategieën om deze problemen te overwinnen. Echter, toepassing van deze algoritmen om fundamenteel slechte kwaliteit/vervormde gegevens zal nog steeds voorkomen dat effectieve analyse. SNR is daarom een van de parameters die wordt gemeten en weergegeven in elektro kaart. Evenzo kan de gebruiker de signalen van specifieke regio’s uit het voorbeeld selecteren en vergelijken met behulp van de pixel info -en vergelijkings modules, waardoor verschijnselen zoals bewegings artefacten in afbeelding 5kunnen worden geïdentificeerd en geschikte uitsluiting van gegevens.

Op dit moment biedt ElectroMap geen ondersteuning voor het verwijderen van bewegings artefacten uit onbewerkte gegevens op dezelfde manier als basislijn correctie. Daarom is een mogelijke toekomstige ontwikkeling van de software opname van bewegings artefact verwijdering door computationele methoden zoals gerapporteerd31,32. Bovendien is ElectroMap momenteel beperkt tot het bestuderen van één optisch signaal. Echter, voor ratiometrische kleurstoffen en gelijktijdig gebruik van spanning en calcium kleurstoffen27, gelijktijdige verwerking van twee golflengte kanalen is vereist. De integratie van dubbele signaalanalyse is daarom een belangrijke toekomstige aanvulling op de software. Uitbreiding van de analyse opties die van toepassing zijn op aritmische gegevenssets, zoals het volgen van fase singulariteit, zou de reikwijdte van de software33,34, even verruimen. Ten slotte kunnen verschillende van de beschreven analyse opties ook nuttig zijn bij het analyseren van de elektrode toewijzingsgegevens. Inderdaad, electromap is gebruikt voor het analyseren van elektrode Mapping gegevens ondanks de contrasterende electrogram golfvorm20,35, en verdere optimalisatie zal het gebruik ervan voor deze modaliteit uit te breiden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door het EPSRC studentship (SCI-PHY-4-Health Centre for Doctoral training L016346) naar D.P., K.R. en L.F., Wellcome Trust Seed Award subsidie (109604/Z/15/Z) aan D.P., British Heart Foundation subsidies (PG/17/55/33087, RG/17/15/33106) aan D.P. , Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 633196 [CATCH ME] bij P.K. en L.F.), British Heart Foundation (FS/13/43/30324 tot P.K. en L.F.; PG/17/30/32961 naar P.K. en A.H.), en Leducq Foundation tot P.K.. J.W. wordt ondersteund door de British Heart Foundation (FS/16/35/31952).

Materials

MATLAB and Simulink R2018a Mathworks, Inc, Natick, MA MATLAB software

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 94, 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110, 609-623 (2012).
  3. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  4. Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local β-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation Research. 110, 1454-1464 (2012).
  5. Syeda, F., et al. PITX2 Modulates Atrial Membrane Potential and the Antiarrhythmic Effects of Sodium-Channel Blockers. Journal of the American College of Cardiology. 68, 1881-1894 (2016).
  6. Winter, J., et al. Sympathetic nervous regulation of cardiac alternans in the intact heart. Frontiers in Physiology. 9, 1-12 (2018).
  7. Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7, 313-320 (2014).
  8. Sato, P. Y., et al. Loss of Plakophilin-2 Expression Leads to Decreased Sodium Current and Slower Conduction Velocity in Cultured Cardiac Myocytes. Circulation Research. 105, 523-526 (2009).
  9. Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging & Visualization. 5, 368-378 (2017).
  10. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
  11. Crocini, C., Ferrantini, C., Pavone, F. S., Sacconi, L. Optogenetics gets to the heart: A guiding light beyond defibrillation. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 132-139 (2017).
  12. Entcheva, E., Bub, G. All-optical control of cardiac excitation: Combined high-resolution optogenetic actuation and optical mapping. The Journal of Physiology. 9, 2503-2510 (2016).
  13. O’Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  14. Yu, T. Y., et al. An automated system using spatial oversampling for optical mapping in murine atria. Development and validation with monophasic and transmembrane action potentials. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 340-348 (2014).
  15. Jaimes, R., et al. Functional response of the isolated, perfused normoxic heart to pyruvate dehydrogenase activation by dichloroacetate and pyruvate. Pflugers Archiv. 468, 131-142 (2016).
  16. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308, H1112-H1125 (2015).
  17. Parrish, D. C., et al. Transient denervation of viable myocardium after myocardial infarction does not alter arrhythmia susceptibility. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory. , (2017).
  18. Ihara, K., et al. Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping. Journal of Visualized Experiments. (132), e56478 (2018).
  19. Holmes, A. P., et al. A Regional Reduction in Ito and IKACh in the Murine Posterior Left Atrial Myocardium Is Associated with Action Potential Prolongation and Increased Ectopic Activity. Plos One. 11, e0154077 (2016).
  20. Lang, D., et al. Arrhythmogenic remodeling of β<inf>2</inf> versus β<inf>1</inf> adrenergic signaling in the human failing heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8, 409-419 (2015).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Wen, Q., et al. Transverse cardiac slicing and optical imaging for analysis of transmural gradients in membrane potential and Ca2+ transients in murine heart. The Journal of Physiology. 596, 3951-3965 (2018).
  23. Houston, C., et al. Characterisation of re-entrant circuit (or rotational activity) in vitro using the HL1-6 myocyte cell line. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 119, 155-164 (2018).
  24. Yu, T. Y., et al. Optical mapping design for murine atrial electrophysiology. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering: Imaging and Visualization. 5, 368-376 (2017).
  25. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 303, H753-H765 (2012).
  26. Bayly, P. V., et al. Estimation of Conduction Velocity Vector Fields from Epicardial Mapping Data. IEEE Transactions on Bio-Medical Engineering. 45, 563-571 (1998).
  27. Jaimes, R., et al. A technical review of optical mapping of intracellular calcium within myocardial tissue. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310, H1388-H1401 (2016).
  28. Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: Ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation Research. 114, 1410-1421 (2014).
  29. Winter, J., Shattock, M. J. Geometrical considerations in cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis. Europace. , (2016).
  30. Mironov, S., Jalife, J., Tolkacheva, E. G. Role of conduction velocity restitution and short-term memory in the development of action potential duration alternans in isolated rabbit hearts. Circulation. 118, 17-25 (2008).
  31. Khwaounjoo, P., et al. Image-Based Motion Correction for Optical Mapping of Cardiac Electrical Activity. Annals of Biomedical Engineering. 43, 1235-1246 (2014).
  32. Christoph, J., Luther, S. Marker-Free Tracking for Motion Artifact Compensation and Deformation Measurements in Optical Mapping Videos of Contracting Hearts. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
  33. Umapathy, K., et al. Phase Mapping of Cardiac Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 3, 105-114 (2010).
  34. Tomii, N., et al. Detection Algorithm of Phase Singularity Using Phase Variance Analysis for Epicardial Optical Mapping Data. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63, 1795-1803 (2016).
  35. Cantwell, C. D., et al. Techniques for automated local activation time annotation and conduction velocity estimation in cardiac mapping. Computers in Biology and Medicine. 65, (2015).

Play Video

Cite This Article
O’Shea, C., Holmes, A. P., Yu, T. Y., Winter, J., Wells, S. P., Parker, B. A., Fobian, D., Johnson, D. M., Correia, J., Kirchhof, P., Fabritz, L., Rajpoot, K., Pavlovic, D. High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap. J. Vis. Exp. (148), e59663, doi:10.3791/59663 (2019).

View Video