Summary

Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

Published: May 11, 2020
doi:

Summary

Qui descriviamo un’immunocattura indiretta del panino ELISA per determinare il contenuto di glicoproteina immunogenica nei vaccini sulla rabbia. Questo test utilizza un anticorpo Monoclonal neutralizzante (mAb-D1) riconoscendo i trimer di lecoproteine. È un’alternativa al test NIH in vivo per seguire la coerenza della potenza del vaccino durante la produzione.

Abstract

La crescente preoccupazione globale per il benessere degli animali sta incoraggiando i produttori e i laboratori nazionali di controllo (OMCL) a seguire la strategia 3Rs per la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dei test sugli animali di laboratorio. Lo sviluppo di approcci in vitro è raccomandato a livello dell’OMS e dell’Europa come alternative al test NIH per valutare la potenza del vaccino della rabbia. Sulla superficie della particella del virus della rabbia (RABV), i trimer di glicoproteina costituiscono il principale immunogeno per indurre gli anticorpi neutralizzanti virali (VNAbs). Un test ELISA, in cui neutralizzare gli anticorpi monoclonali (mAb-D1) riconosce la forma trimerica della glicoproteina, è stato sviluppato per determinare il contenuto della glicoproteina trimeric piegata nativa insieme alla produzione dei lotti di vaccino. Questo test di potenza in vitro ha dimostrato una buona concordanza con il test NIH ed è stato trovato adatto in sperimentazioni collaborative da parte dei produttori di vaccini RABV e oMCL. L’evitare l’uso degli animali è un obiettivo realizzabile nel prossimo futuro.

Il metodo presentato si basa su un’immunocattura indiretta del sandwich ELISA utilizzando l’mAb-D1 che riconosce i siti antigenici III (aa 330 a 338) della glicoproteina trimovina RABV, cioè l’antigene rabV immunogenico. mAb-D1 viene utilizzato sia per il rivestimento che per il rilevamento dei trimer glicoproteici presenti nel lotto di vaccino. Poiché l’epitopo è riconosciuto a causa delle sue proprietà conformazionali, la glicoproteina potenzialmente denaturata (meno immunogenica) non può essere catturata e rilevata dal mAb-D1. Il vaccino da testare viene incubato in una piastra sensibilizzata con il mAb-D1. Le glicoproteine RABV trimeric legate vengono identificate aggiungendo nuovamente il mAb-D1, etichettato con perossidasi e poi rivelato in presenza di substrato e cromogeno. Il confronto dell’assorbimento misurato per il vaccino testato e il vaccino di riferimento consente la determinazione del contenuto di glicoproteina immunogenica.

Introduction

Da più di 50 anni, il test NIH1 viene utilizzato come metodo gold standard per valutare la potenza del vaccino antirabbico prima del rilascio del lotto. Questo test consiste in un’immunizzazione intraperitale di gruppi di topi con il vaccino da testare seguita da una sfida intra-cerebrale (IC) 14 giorni dopo con il ceppo del virus della rabbia (RABV) Challenge Virus Standard (CVS). La potenza viene valutata dalla percentuale di topi che sopravvivono alla sfida IC. Sebbene l’OMS2 e la Pharmacopeia3 europea richiedano ancora il test NIH per valutare la potenza del vaccino, questo test subisce diversi ostacoli: i risultati sono altamente variabili4; il RABV infettivo viene utilizzato durante la sfida e ciò richiede sia abilità tecniche che severe misure di biosicurezza; viene utilizzato un gran numero di animali, e la gravità della sfida solleva gravi preoccupazioni etiche5. È stata sviluppata una variazione meno grave di questo test: due settimane dopo l’immunizzazione intra-peritoneale, i topi non sono sfidati da IC, ma sanguinano e testati per la presenza di specifici anticorpi di neutralizzazione RABV (VNAbs) nel loro siero utilizzando un test di neutralizzazione in vitro. Tuttavia, questo test richiede ancora di sacrificare un gran numero di topi di laboratorio, anche se è già in uso per i vaccini veterinari6,7 ed è stato considerato per i vaccini umani8.

Al momento, sia l’International9 che l’European10 raccomandazioni incoraggiano i produttori e i laboratori nazionali di controllo (Official Medicine Control Laboratories – OMCLs) ad attuare la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dei test sugli animali di laboratorio, indicati come strategia 3R. La direttiva europea 2010/63/EU (in vigore dal 2013/01/01) relativa alla protezione e al benessere degli animali ha inoltre rafforzato i vincoli per i produttori e i laboratori di vaccini coinvolti nel controllo della qualità dei vaccini sulla rabbia e nella ricerca sulla rabbia11. Di conseguenza, lo sviluppo, la convalida e l’uso di approcci alternativi in vitro sono diventati una priorità. Questi non sono solo eticamente sani, ma possono anche ridurre i costi di test in batch e ridurre il tempo per i risultati a ore invece di settimane3.

Sulla superficie della particella RABV, la glicoproteina adotta una forma trimrica12,13,14,15,16. Nel vaccino antirabbico, questa forma trimeric autoctona costituisce il principale immunogeno che induce VNAbs17 mentre le lecoproteine monomeriche, solubili o denaturesono scarsamente immunogeniche18,19. Pertanto, la conservazione dei trimer della glicoproteina lungo il processo di produzione del vaccino è un buon indicatore per la conservazione di un potenziale immunogenico ottimale. Diversi metodi immunochimici, come il test anticorpo-legante20,21, il test di immunodiffusione singola radiale (SRD)22 e il test ELISA23,24,25,26,27 sono raccomandati dalla relazione tecnica dell’OMS Serie2 e dalla monografia europea3 per quantificare il contenuto dell’antigene nei vaccini antirabbii. Questi sono utilizzati dai produttori per monitorare la consistenza della produzione di vaccini e dall’OMCL per valutare la formulazione coerente di lotti di vaccini umani28, anche se il test NIH è ancora considerato per la potenza.

Tuttavia, tutti questi metodi immunochimici non sono equivalenti. Il test SRD richiede un pretrattamento che può alterare i trimer a membrana ancorati e provocare una forma solubile o denaturata della glicoproteina22,29. Pertanto, la SRD non è molto efficiente nel discriminare tra le glicoproteine immunogeniche e non immunogeniche con conseguente valutazione imperfetta dell’immunogenicità di un lotto di vaccino. Al contrario, il test ELISA è più sensibile22, conserva la struttura nativa della glicoproteina ed è più appropriato per determinare il contenuto dei trimernativi piegati nativamente di glicoproteina. Il test ELISA può utilizzare anticorpi anticlonali monoclonali di coniglio o murini monoclonali purificati o concentrati con solfato di ammonio. Gli studi hanno dimostrato una buona concordanza tra il test NIH e il contenuto di antigene valutato da ELISA nei vaccini e hanno concluso che i metodi ELISA sono adatti per il test di potenza in vitro. Questo sostiene che i test ELISA potrebbero almeno integrare o addirittura sostituire il test NIH4,26,27,30,31,32,33. Oggi, la Farmacocottoeia europea raccomanda l’uso di saggi sierologici o immunochimici convalidati come alternative al test NIH3 . La completa prevenzione dell’uso animale per la potenza vaccinale è diventata una prospettiva realistica.

Il metodo presentato di seguito si basa su un immunocattura sandwich ELISA indiretto utilizzando un clone anticorpo monoclonale del topo (mAb-D1) che riconosce i siti antigenici III (aa 330 a 338) della glicoproteina trimerica RABV15,34. Questo metodo è stato sviluppato inizialmente presso l’Institut Pasteur26,30 poi ottimizzato e convalidato dal laboratorio Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), cioè il francese OMCL4,33. Il mAb-D1 viene utilizzato sia per sensibilizzare la piastra che successivamente per rilevare l’antigene catturato. Ciò consente la quantificazione specifica dei trimer glicoproteici, cioè l’antigene rabV immunogenico. Il mAb-D1 utilizzato per il rilevamento è etichettato con perossidasi, che si rivela in presenza del substrato e del cromogeno. Il confronto dell’assorbimento misurato per il vaccino testato e il vaccino di riferimento consente la determinazione del contenuto di glicoproteina immunogenica. È di nota che lo stesso tipo di saggio può essere applicato a diversi mAbs riconoscendo diversi siti antigenici della glicoproteina RABV35. Il metodo per ottenere e purificare o concentrarsi con anticorpo anti-glicoproteina policlonale immunoglobuline G (IgG) o globuline mureali monoclonali sono stati ampiamente descritti in precedenza36 insieme al metodo per coniugare anticorpi con perossidasi37.

Protocol

1. Precauzioni di sicurezza NOTA: questo metodo è applicabile sia al RABV vivo che al vaccino inattivato. Utilizzare le buone procedure di pratica e sicurezza di laboratorio. Indossare attrezzature di protezione personale (PPE) adeguate, tra cui cappotto usa e getta, guanti, maschera, occhiali, ecc. Quando il virus vivo è titolato, utilizzare un mobile di sicurezza biologica di classe II. Considerare qualsiasi materiale a contatto con i campioni (reagent…

Representative Results

Nell’esempio seguente viene utilizzato il vaccino di riferimento Lot 09, costituito da particelle di virus della rabbia inattivate purificate (ceppo vaccino fotovoltaico). Il contenuto di tagliatrici di glicoproteine (10 g/mL) in questo è stato stabilito dopo la determinazione della quantità totale di proteine virali (test BCA) e la valutazione della percentuale della glicoproteina da sDS-poliacritilmide gel elettroforesi. In alternativa, può essere utilizzato un vaccino di riferimento…

Discussion

L’epitopo riconosciuto dal mAb-D1 si trova nel sito antigenico III della glicoproteina RABV che non è solo immuno-dominante per l’induzione di VNAbs, ma anche coinvolto nella neurovirulenza, patogenicità40,41 e riconoscimento del recettore42. C’è un altro importante sito antigenico lungo la glicoproteina, sito II43, contro il quale diversi MAbs sono stati isolati come mAb-WI-111235. Questi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La dott.ssa Sylvie Morgeaux e il Dr. Jean-Michel Chapsal devono essere riconosciuti per la loro partecipazione chiave per stabilire il test ELISA sui lotti di vaccino e per organizzare workshop internazionali e studi collaborativi. Ringraziamo Sabrina Kali per la lettura critica del manoscritto. Il Dr. Pierre Perrin era responsabile dell’isolamento e della caratterizzazione di mAb-D1. Questo lavoro è stato principalmente sostenuto dai finanziamenti dell’Institut Pasteur.

Materials

Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96
Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

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Cite This Article
Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

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