Hier beschrijven we een indirecte ELISA sandwich immunocapture om de immunogene glycoproproteïnegehalte in rabiësvaccins te bepalen. Deze test maakt gebruik van een neutraliserende Monoclonal Antibody (mAb-D1) herkennen glycoproproproteïne trimers. Het is een alternatief voor de in vivo NIH-test om de consistentie van de potentie van het vaccin tijdens de productie te volgen.
De groeiende wereldwijde zorg voor het dierenwelzijn moedigt fabrikanten en de Nationale Controlelaboratoria (OL’s) aan om de 3Rs-strategie voor de vervanging, vermindering en verfijning van het laboratoriumdierproeven te volgen. De ontwikkeling van in vitro benaderingen wordt aanbevolen op het WHO- en Europees niveau als alternatieven voor de NIH-test voor de evaluatie van de potentie van rabiësvaccin. Aan het oppervlak van het rabantievirus (RABV) vormen trimers van glycoproteïne de belangrijkste immunogen die virale neutraliserende antilichamen (VNAbs) veroorzaken. Een ELISA-test, waarbij monoklonale antilichamen (mAb-D1) de trimeric vorm van het glycoproteïne herkennen, is ontwikkeld om de inhoud van het inheemse gevouwen trimeric glycoproteïne samen met de productie van de vaccinbatches te bepalen. Deze in vitro potentie test toonde een goede overeenstemming met de NIH-test en is geschikt bevonden in gezamenlijke proeven door RABV vaccin fabrikanten en OL’s. Het vermijden van dierlijk gebruik is een haalbaar doel in de nabije toekomst.
De gepresenteerde methode is gebaseerd op een indirecte ELISA sandwich immunocapture met behulp van de mAb-D1 die de antigene sites III (aa 330 tot 338) van het trimeric RABV glycoproteïne herkent, d.w.z. het immunogene RABV-antigeen. mAb-D1 wordt gebruikt voor zowel coating als detectie van glycoproproproteïne trimers die aanwezig zijn in de vaccinbatch. Aangezien het epitoop wordt herkend vanwege zijn conformatie-eigenschappen, kan het potentieel gedenatureerde glycoproteïne (minder immunogeen) niet worden opgevangen en gedetecteerd door de mAb-D1. Het te testen vaccin wordt geïncubeerd in een plaat die is gesensibiliseerd met de mAb-D1. Gebonden trimeric RABV glycoproteïnen worden geïdentificeerd door het toevoegen van de mAb-D1 opnieuw, gelabeld met peroxidase en vervolgens onthuld in de aanwezigheid van substraat en chromogen. Vergelijking van de voor het geteste vaccin gemeten absorptiemiddel en het referentievaccin maakt de bepaling van het immunogene glycoproteïnegehalte mogelijk.
Sinds meer dan 50 jaar wordt de NIH-test1 gebruikt als een gouden standaardmethode om de potentie van het rabiësvaccin vóór de batchrelease te evalueren. Deze test bestaat uit een intraperitoneale immunisatie van groepen muizen met het te testen vaccin, gevolgd door een intracerebrale (IC) uitdaging 14 dagen later met de Challenge Virus Standard (CVS) stam van rabiësvirus (RABV). De potentie wordt geëvalueerd vanuit het aandeel muizen dat de IC-uitdaging overleeft. Hoewel who2 en European Pharmacopeia3 nog steeds de NIH-test vereisen voor de beoordeling van de vaccinpotentie, lijdt deze test aan verschillende hindernissen: de resultaten zijn zeer variabel4; besmettelijke RABV wordt gebruikt tijdens de uitdaging en dit vereist zowel technische vaardigheid als strikte bioveiligheidsmaatregelen; grote aantallen dieren worden gebruikt, en de ernst van de uitdaging roept ernstige ethische bezwaren op5. Een minder ernstige variatie van deze test is ontwikkeld: twee weken na de intra-peritoneale immunisatie worden muizen niet uitgedaagd door IC, maar gebloed en getest op de aanwezigheid van specifieke RABV neutraliserende antilichamen (VNAbs) in hun serum met behulp van een in vitro neutralisatietest. Deze test vereist echter nog steeds het opofferen van een groot aantal laboratoriummuizen, hoewel deze al wordt gebruikt voor de veterinaire vaccins6,7 en in aanmerking is genomen voor menselijke vaccins8.
Vanaf nu moedigen zowel internationale9- als Europese10-aanbevelingen fabrikanten en nationale controlelaboratoria (Official Medicine Control Laboratories – OL’s) aan om de vervanging, vermindering en verfijning van laboratoriumdierproeven uit te voeren, de zogenaamde 3Rs-strategie. De Europese Richtlijn 2010/63/EU (die sinds 2013/01/01 van kracht is) met betrekking tot de bescherming en het welzijn van dieren heeft ook de beperkingen versterkt voor vaccinfabrikanten en laboratoria die betrokken zijn bij de kwaliteitscontrole van rabiësvaccins en bij onderzoek naar rabiës11. Als gevolg hiervan zijn de ontwikkeling, validatie en het gebruik van alternatieve in vitro benaderingen nu een prioriteit geworden. Deze zijn niet alleen ethisch verantwoord, maar kunnen ook de kosten voor batchtesten verlagen en de tijd voor resultaten verkorten tot uren in plaats van weken3.
Aan het oppervlak van het RABV-deeltje neemt het glycoproteïne een trimeric vormaan 12,13,14,15,16. In rabiësvaccin vormt deze inheemse trimeric vorm de belangrijkste immunogen inducerende VNAbs17, terwijl de monomeric, oplosbare of gedenatureerde glycoproteïnen slecht immunogene18,19zijn. Zo is het behoud van trimers van het glycoproteïne langs het vaccinproductieproces een goede indicator voor het behoud van een optimaal immunogeen potentieel. Verschillende immunochemische methoden, zoals de antilichaambindingstest20,21,de enkelvoudige radiale immunodiffusie (SRD) test22 en de ELISA-test23,24,25,27,27 worden aanbevolen door de WHO Technical Report Series2 en de Europese monografie3 om het antigeengehalte in rabiësvaccins te kwantificeren. Deze worden gebruikt door fabrikanten om de consistentie van de productie van vaccins te controleren en door de OMCL om de consistente formulering van partijen menselijke vaccins28tebeoordelen, zelfs als de NIH-test nog steeds in aanmerking komt voor de potentie.
Echter, al deze immunochemische methoden zijn niet gelijkwaardig. De SRD-test vereist een voorbehandeling die de membraanverankerde trimers kan veranderen en kan resulteren in een oplosbare of gedenatureerde vorm van het glycoproteïne222,29. Daarom is SRD niet veel efficiënt in het discrimineren tussen immunogene en niet-immunogene glycoproteïnen wat resulteert in een onvolmaakte beoordeling van de immunogeniciteit van een vaccinpartij. Daarentegen is de ELISA-test gevoeliger22, behoudt de oorspronkelijke structuur van het glycoproteïne en is het beter om de inhoud van de native gevouwen trimers van glycoproteïne te bepalen. De ELISA-test kan gebruik maken van konijnenpolyklonale of muismonoklonale anti-glycoproteïneantilichamen gezuiverd of geconcentreerd met ammoniumsulfaat. Studies hebben aangetoond goede overeenstemming tussen de NIH-test en het antigeengehalte geëvalueerd door ELISA in vaccins en concludeerde dat ELISA-methoden geschikt zijn voor de in vitro potentie test. Dit pleit ervoor dat ELISA-tests op zijn minst de NIH-test4,26,27,30,31,32,33kunnen aanvullen of zelfs vervangen ., Vandaag beveelt de Europese Farmacopee het gebruik aan van gevalideerde serologische of immunochemische tests als alternatief voor de NIH-test3. Het volledig vermijden van dierlijk gebruik voor vaccinpotentie is een realistisch perspectief geworden.
De onderstaande methode is gebaseerd op een indirecte ELISA sandwich immunocapture met behulp van een muis monoklonale antilichaam kloon (mAb-D1) die de antigene sites III (aa 330 tot 338) van de trimeric RABV glycoproteïne15,34herkent. Deze methode werd in eerste instantie ontwikkeld aan het Institut Pasteur26,30 vervolgens geoptimaliseerd en gevalideerd door de Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, dat wil zeggen, de Franse OMCL4,33. De mAb-D1 wordt zowel gebruikt voor het sensibiliseren van de plaat als vervolgens voor het detecteren van het gevangen antigeen. Dit maakt de specifieke kwantificering van de glycoproproteïne trimers mogelijk, d.w.z. het immunogene RABV-antigeen. De mAb-D1 die voor de detectie wordt gebruikt, is gelabeld met peroxidase, wat wordt onthuld in aanwezigheid van het substraat en chromogen. Vergelijking van de voor het geteste vaccin gemeten absorptiemiddel en het referentievaccin maakt de bepaling van het immunogene glycoproteïnegehalte mogelijk. Het is van belang dat hetzelfde type test kan worden toegepast voor verschillende mAbs herkennen verschillende antigene sites van de RABV glycoproteïne35. De methode om met ammoniumsulfaat anti-glycoproteïne polyklonkonijn immunoglobulinen G (IgG) of monoklonale muisglobuline te verkrijgen en te zuiveren of te concentreren, is eerder uitgebreid beschreven36 samen met de methode om antilichamen met peroxidase37te vervoegen..
Het epitoop dat door de mAb-D1 wordt erkend, bevindt zich in de antigene plaats III van het RABV-glycoproteïne, dat niet alleen immunodominant is voor de inductie van VNAbs, maar ook betrokken is bij neurovirulence, pathogeniteit40,41 en receptorherkenning42. Er is nog een andere belangrijke antigene site langs het glycoproteïne, site II43, waartegen verschillende MAbs zijn geïsoleerd, zoals mAb-WI-1112<sup class…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Sylvie Morgeaux en Dr. Jean-Michel Chapsal moeten worden erkend voor hun belangrijkste deelname aan de ELISA-test op vaccinbatches vast te stellen en internationale workshops en samenwerkingsstudies te organiseren. Wij danken Sabrina Kali voor het kritisch lezen van het manuscript. Dr. Pierre Perrin was verantwoordelijk voor de isolatie en karakterisering van mAb-D1. Dit werk werd voornamelijk ondersteund door de financiering van het Institut Pasteur.
Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |