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Cancer Research

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

Published: June 26, 2019
doi:
10.3791/59633
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Structural Biology,Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center,Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program,Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery,Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology,Montefiore Medical Center

Summary

우리는 쥐에 있는 고분자량 (155 kDa) dextran의 정맥 주입을 사용하여 전이 (TMEM) 출입구 기능 및 암 세포 intravasation의 종양 미세 환경과 관련되었던 과도 혈관 투과성을 평가하기 위한 2개의 방법을 기술합니다. 방법은 살아있는 동물에 있는 활력 화상 진찰 및 면역 형광을 사용하여 고정된 조직 분석을 포함합니다.

Abstract

암 관련 사망의 가장 흔한 원인은 전이이며, 1 차 종양에서 이차 부위로 암세포를 보급해야하는 과정입니다. 최근에, 우리는 1 차적인 유방암에 있는 암 세포 보급이 폐에 있는 전이성 사이트에 전이의 종양 MicroEnvironment에게 불린 출입구에서만 발생한다는 것을 설치했습니다 (TMEM). TMEM 출입구 번호는 유방암 환자에서 전이성 질환의 먼 재발에 대한 예후입니다. TMEM 출입구는 이 두 세포가 혈액에 단단히 결합되어 있는 TIE2및 VEGF의 상부를 발현하는 경막, proangiogenic 대식세포와 직접 접촉하여 액틴 조절 단백질 Mena를 과발현하는 암세포로 구성됩니다. 혈관 내피 세포. 암세포는 TMEM 관련 대식세포 및 TMEM 관련 메나 발현 암 세포의 관절 활성에 의해 조율된 일시적인 혈관 투과성으로 인해 TMEM 출입구를 통해 인트라스타시화할 수 있다. 이 원고에서, 우리는 TMEM 중재한 과도 혈관 투과성의 평가를 위한 2개의 방법을 기술합니다: 활력 화상 진찰 및 고정된 조직 면역 형광. 두 방법 모두 장점과 단점을 가지고 있지만, 두 가지를 결합하면 TMEM 기능을위한 미세 환경 전제 조건뿐만 아니라 TMEM 매개 혈관 투과성의 가장 완벽한 분석을 제공 할 수 있습니다. 유방암에 있는 전이성 프로세스, 및 가능하게 그밖 모형암때문에, TMEM 출입구를 통해암세포 보급을 관련시키기 때문에, TMEM 출입구 활동의 분석을 위한 잘 확립된 방법을 채택하는 것이 필수적입니다. 여기에 설명된 두 가지 방법은 암세포를 예방하는 제제의 전임상 시험에서 가장 중요한 순진한 동물또는 약리학적으로 처리된 동물에서 TMEM 출입구 활성 분석에 대한 포괄적인 접근법을 제공합니다. TMEM을 통해 보급될 수 있습니다.

Introduction

암 전이에 대한 우리의 이해에 있는 최근 어드밴스는 상피-중간엽 전이 (EMT) 및 철새/침략적인 암 세포 소집단의 유도가, 그 자체로, 혈류 보급을 위해 충분하지 않다는 것을 발견했습니다 1. 실제로, 종양 관절이 종종 낮은 pericyte 커버리지를 특징으로하기 때문에 암 관련 내피의 전체를 통해 암 세포를 전이하는 것은 매우 투과성이 고도로 투과성이 있다고 생각되었다. 불안정한2,3,4. 종양 내의 불완전한 기능의 높게 암시하더라도, 발암 도중 혈관 수정은 종양 세포가 통제되지 않는 방식으로 혈관을 쉽게 관통할 수 있다는 것을 se 당 증거를 제공하지 않습니다. 종양 세포가 형광 태그가 부착되고 혈관 구조가 형광 프로브의 정맥 주사를 통해 표지되는 Intravital 이미징 (IVI) 연구에서 얻은 통찰력은 종양 혈관이 균일하게 진행되는 동안 형광 프로브 (예 : dextran 또는 양자점)의 정맥 주사를 통해 표지됩니다. 낮은 분자량 덱스 트랜스 (예를 들어 70 kD), 고분자 덱스 트랜스 (155 kD) 및 종양 세포에 투과성 혈관 분기 점에 우선적으로 위치한 내화의 전문 부위에서만 내피를 교차 할 수 있습니다5, 6개 , 7.동물 모델과 인간 환자 유래 물질을 사용한 면역성 화학 (IHC) 분석은 이러한 사이트가 혈관 투과성을 국부적으로 및 일시적으로 조절하는 “출입구”임을 보여주었습니다. 순환을 입력 하는 철새/침략적인 암 세포에 대 한 기회. 이러한 출입구는 “전이의 종양 미세 환경”또는 “TMEM”이라고하며, 예상대로, 그들의 밀도는 유방암 환자에서 전이성 질환을 개발할위험이 증가와 상관 관계 8,9, 10.

각 TMEM 출입구는 세 가지 유형의 세포로 구성되어 있습니다: 시막 대식세포, 액틴 조절 단백질 포유류 를 과도하게 발현하는 종양 세포(Mena), 및 내피 세포, 모두 서로 직접 적인접촉1, 5,9,10,11,12,13. TMEM이 내막통로로서의 기능을 위한 주요 이벤트는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 근간 대식세포(14)에 의해 기본 혈관상에국지화방출하는 것이다. VEGF는 내피 세포15,16,17,18,19,일시적인 혈관 누설을 초래하는 현상, 또한 사이의 상모 접합을 방해 할 수 있습니다. IVI 연구에 설명 된 대로 “파열”투과성으로 알려진 5. TMEM 대식세포는 VEGF 매개 TMEM 기능 및 이러한 대식세포의 호밍에 필요한 티로신 키나아제 수용체 TIE2를 경측틈새 시장5,20,21로 발현하는 것으로 나타났다. , 22. 암 세포 보급 및 전이를 조절하는 것 외에도 TIE2+ 대식세포는 종양 혈관 신생의 중심 조절자로 나타났습니다21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. 이와 같이, TIE2+ 대식세포는 종양 미세환경 및 전이성 캐스케이드의 주요 조절제의 중요한 성분을 나타낸다.

TMEM 매개 혈관 투과성 (즉, “파열”)을 더 잘 개념화하려면 내피 세포 – 세포 접합의 용해와 관련이없는 다른 혈관 투과성 모드와 구별하는 것이 매우 중요합니다. 손상되지 않은 내피 (단단하고 접합 접합이 중단되지 않는 혈관 투과성)의 세 가지 주요 유형이 있습니다 : (a) 섭취 된 물질의 트랜스 시토시스에 결합 될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. (b) 내피페네스트라를 통한 물질의 수송; (c) 내피 단단한 접합부15,16,17,18,19,32에 의해 조절되는 파라셀룰러 통로를 통한 물질의 수송 , 33세 , 34. 비록 많은 종양에서 조절되었지만, 앞서 언급한 혈관 투과성 모드는 정상 조직 생리학 및 항상성의 맥락에서 주로 기술되어 왔으며, 그 중 극단은 제한된 투과성을 가진 조직이다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽, 혈액-고환 장벽), 또는 풍부한 투과성(예를 들어, 신장 사구체 장치의 페네스티드 모세혈관)34,35,36,37.

다광체 내 화상 진찰 및 다중면역형 광형 현미경 검사법을 사용하여, 우리는 유방 종양에 있는 TMEM 중재한 관 투과성 (“파열”) 및 유방 종양에 있는 관 투과성의 그밖 모드 사이에서 구별할 수 있습니다. 이를 달성하기 위해, 우리는 마우스에서 고분자, 형광 표지 프로브의 단일 정맥 주입을 수행합니다. 자발적인 파열 이벤트는 다음 라이브 마우스에서 활력 내 이미징을 사용하여 캡처 할 수 있습니다; 또는 대안적으로, 프로브의 외삽은 혈액 혈관 구조 (예를 들어 CD31+ 또는 Endomucin +) 및 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 TMEM 출입구와 공동 국소화 연구에 의해 정량화 될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜은 독립적으로 또는 서로 함께 사용할 수 있는 이러한 기술을 모두 설명합니다.

Protocol

살아있는 동물을 사용하는 모든 실험은 동물 사용 및 관리 지침 및 규정에 따라 수행되어야합니다. 이 연구에서 설명한 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 보건원 규정에 따라 수행되었으며 알버트 아인슈타인 의과 대학동물 관리 및 사용의 승인을 받았습니다. 위원회 (IACUC). 1. 살아있는 동물 화상 진찰을 이용한 “파열 투과성” 평가 형광 대식 세포와 …

Representative Results

이 프로토콜 문서에 설명된 실험 절차는 그림 1 A-C에간략하게 요약되고 설명되어 있습니다. TMEM 매개 혈관 투과성(“파열 활성”)을 측정하고 다른 혈관 투과성 모드(즉, 소개에서 설명한 대로 세포 간 및 파라셀룰러)의 실험 소음을 줄이기 위해 정맥 내(i.v.) 155 kDa Dextran과 같은 고분자량 프로브를 테트라메틸 로다민에 공액화합니다. 낮은 분자?…

Discussion

여기에서는 TMEM 출입구에 존재하고 혈관 이체의 중단과 연관된 특정 유형의 혈관 투과성을 시각화하고 정량화하기 위해 적용할 수 있는 두 가지 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 혈관 투과성의 이 모형은5위에 설명된 것과 같이 삼자 TMEM 세포 복합체에 의해 일시적이고 통제됩니다. TMEM 관련 혈관 투과성을 확인하고 정량화하는 능력은 종양에 대한 기존의 세포 독성 요법의 효?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 화상 진찰 지원을 위한 알버트 아인슈타인 의과 대학에 있는 분석 화상 진찰 시설 (AIF)에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NCI (P30CA013330, CA150344, CA150324, CA216248), SIG 1S10OD019961-01, 그루스 -리퍼 바이오 포토닉스 센터 및 통합 이미징 프로그램, 몬테피오레의 루스 L Kirsch 2 의 교육에서 보조금에 의해 지원되었다. 종양 미세 환경 연구 (CA200561).

GSK는 원고를 공동 작성하고, 도 면 1C 및 3B에 대한 이미징을 수행하고, 고정 조직 분석 프로토콜을 개발하고, 모든 데이터를 분석하고 해석합니다. JMP는 원고를 공동 작성하고, 도 1B,2C 및 3A에 대한 수술 및 사내 영상을 수행; LB & AC는 도 2B에 대한 수술 및 인바이탈 이미징을 수행; RJ는 도 2A에 대한 수술 및 활력 내 이미징을 수행; JSC는 원고를 공동 작성하여 모든 데이터를 분석하고 해석했습니다. MHO는 원고를 공동 작성하여 모든 데이터를 분석하고 해석했습니다. DE는 도 2D를 위한 수술 및 활력 내 이미징을 수행하고, 원고를 공동 작성하고, 고정 조직 분석 및 활력 내 이미징 프로토콜을 개발하고, 모든 데이터를 분석하고 해석했다.

Materials

Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835
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References

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Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).
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