We beschrijven twee methoden voor het beoordelen van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit geassocieerd met tumor micro omgeving van metastasen (tmem) deuropening functie en kankercel intravasatie met behulp van intraveneuze injectie van hoog-moleculair gewicht (155 kDa) dextran bij muizen. De methoden omvatten intravital beeldvorming in levende dieren en vaste weefsel analyse met behulp van immunofluorescentie.
De meest voorkomende oorzaak van kanker gerelateerde sterfte is metastase, een proces dat de verspreiding van kankercellen van de primaire tumor naar secundaire sites vereist. Onlangs hebben we vastgesteld dat kankercel verspreiding in primaire borstkanker en bij gemetastaseerde plaatsen in de longen alleen bij deuropeningen wordt genoemd tumor micro omgeving van metastasen (TMEM). Tmem deuropening nummer is prognostisch voor verre herhaling van gemetastaseerde ziekte bij borstkankerpatiënten. TMEM-deuropeningen bestaan uit een kankercel die het actine-regulerend eiwit Mena in direct contact met een perivasculaire, proangiogene macrofaag, dat een hoog gehalte aan TIE2 en VEGF uitdrukt, waarbij beide cellen strak gebonden zijn aan een bloed het schip endotheliale cel. Kankercellen kunnen intravaseren door middel van tmem doorgangen als gevolg van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit georkestreerd door de gezamenlijke activiteit van de tmem-geassocieerde macrofaag en de tmem-geassocieerde Mena-uitdrukken kanker cel. In dit manuscript beschrijven we twee methoden voor de beoordeling van TMEM-gemedieerde voorbijgaande vasculaire permeabiliteit: intravital Imaging en vaste weefsel immunofluorescentie. Hoewel beide methoden hun voor-en nadelen hebben, kan het combineren van de twee de meest complete analyses van TMEM-gemedieerde vasculaire permeabiliteit en micromilieuvereisten voor TMEM-functie bieden. Aangezien het metastatische proces bij borstkanker, en mogelijk andere vormen van kanker, de verspreiding van kankercellen via tmem deuropeningen impliceert, is het essentieel om goed gevestigde methoden te gebruiken voor de analyse van de tmem deuropening activiteit. De twee methoden die hier worden beschreven, bieden een alomvattende benadering van de analyse van tmem deuropening-activiteit, hetzij bij naïeve of farmacologisch behandelde dieren, wat van het allergrootste belang is voor preklinische onderzoeken van agenten die kankercellen voorkomen verspreiding via TMEM.
Recente vooruitgang in ons begrip van kanker metastasen hebben blootgelegd dat epitheliale-naar-mesenchymale overgang (EMT) en de inductie van een migratie/invasieve kankercel subpopulatie niet, op zichzelf, voldoende zijn voor hematogene verspreiding 1. inderdaad, er werd eerder gedacht dat metastaserende kankercellen intravasaat door het geheel van kanker-geassocieerde endotheel als de tumor neovasculature wordt vaak gekenmerkt door lage pericyte dekking, en als zodanig, is zeer permeabel en unstable2,3,4. Hoewel zeer suggestief van defecte functies binnen de tumor, vasculaire modificaties tijdens carcinogenese leveren geen bewijs per se dat tumorcellen kunnen doordringen van de bloedvaten gemakkelijk en op een ongecontroleerde manier. Inzichten van intravital Imaging (IVI) studies, waarin tumorcellen zijn fluorescerende-gelabeld en de vasculatuur wordt gelabeld via de intraveneuze injectie van fluorescerende sondes (zoals dextran of Quantum dots), tonen aan dat, terwijl de tumor vaten zijn uniform permeabel tot laag moleculair gewicht dextranen (bv. 70 KD), hoog moleculair gewicht dextranen (155 KD) en tumorcellen kunnen alleen het endotheel oversteken op gespecialiseerde plaatsen van intravasatie die bij voorkeur op vasculaire tak punt5zijn gelegen, 6 , 7. Immunohistochemical (IHC) analyses met behulp van dierlijke modellen en menselijke patiënt afgeleide materialen hebben aangetoond dat deze sites zijn “deuropeningen” die gespecialiseerd zijn in het reguleren van vasculaire permeabiliteit, lokaal en transitief, het verstrekken van een kort venster van kans op migratie/invasieve kankercellen om de circulatie te betreden. Deze deuropeningen worden “tumor micro-omgeving van metastasen” of “tmem” genoemd, en, heel expectedly, de dichtheid correleert met een verhoogd risico op het ontwikkelen van gemetastaseerde ziekte bij borstkankerpatiënten8,9, 10.
Elke tmem deuropening bestaat uit drie verschillende soorten cellen: een perivasculaire macrofaag, een tumor cel die de actin-regulatoire proteïne zoogdier ingeschakeld (Mena) en een endotheelcel in direct fysiek contact met elkaar uitdrukt 5,9,10,11,12,13. De belangrijkste gebeurtenis voor de functie van tmem als een intravasatie deuropening is de gelokaliseerde afgifte van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) op het onderliggende vat door de perivasculaire macrofaag14. VEGF kan homotypische kruisingen tussen endotheel cellen15,16,17,18,19, een fenomeen dat resulteert in voorbijgaande vasculaire lekkage verstoren, ook bekend als “barsten” permeabiliteit zoals beschreven in IVI studies 5. Tmem macrofagen is aangetoond dat de tyrosine kinase receptor TIE2 uitdrukken, die nodig is voor VEGF-gemedieerde tmem functie en homing van deze macrofagen aan de perivasculaire niche5,20,21 , 22. naast het reguleren van de verspreiding van kankercellen en metastase zijn TIE2+ macrofagen centrale regulatoren van tumor angiogenese21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Als zodanig, TIE2+ macrofagen vertegenwoordigen een kritische bestanddeel van de tumor micro omgeving en de belangrijkste regulator van de gemetastaseerde Cascade.
Om de TMEM-gemedieerde vasculaire permeabiliteit beter te kunnen conceptualiseren (d.w.z. “barsten”), is het zeer belangrijk om het te onderscheiden van andere vormen van vasculaire permeabiliteit die niet zijn geassocieerd met het oplossen van endotheliale celcelknooppunten. In een intact endotheel (waarvan de nauwe en aanhankings knooppunten niet verstoord zijn), zijn er drie hoofdtypen van vasculaire permeabiliteit: (a) Pinocytose, die kan, of kan niet, worden gekoppeld aan transcytose van het ingezoomde materiaal; b) vervoer van materiaal via endotheel fenestrae; en (c) transport van materiaal via de paracellulaire route, die wordt gereguleerd door endotheliale strakke knooppunten15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Hoewel gedereguleerd in veel tumoren, zijn de bovengenoemde vormen van vasculaire permeabiliteit meestal beschreven in de context van normale weefsel fysiologie en homeostase, waarvan de uitersten weefsels zijn met ofwel beperkte permeabiliteit ( bijvoorbeeld, bloed-hersen barrière, bloed-testis barrière), of overvloedige permeabiliteit (bijvoorbeeld, fenestrated capillairen van het nierglomerulaire apparaat)34,35,36,37.
Met behulp van multiphoton intravital beeldvorming en Multiplexed immunofluorescentie microscopie, we zijn in staat om onderscheid te maken tussen TMEM-gemedieerde vasculaire permeabiliteit (“barsten”) en andere vormen van vasculaire permeabiliteit in borsttumoren. Om dit te bereiken, voeren we een enkelvoudige intraveneuze injectie van een hoog-moleculair gewicht, fluorescently-gelabelde sonde in muizen. Spontane uitbarstende gebeurtenissen kunnen vervolgens worden vastgelegd met intravital imaging in levende muizen; of als alternatief kan extravasatie van de sonde worden gekwantificeerd door co-lokalisatie studies met bloedvasculatuur (bijv. CD31+ of Endomucin+) en tmem-deuropeningen met behulp van immunofluorescentie microscopie. De hier gepresenteerde protocollen beschrijven beide technieken, die zelfstandig of in combinatie met elkaar kunnen worden gebruikt.
Hier schetsen we twee protocollen die kunnen worden toegepast om een specifiek type vasculaire permeabiliteit te visualiseren en te kwantificeren dat aanwezig is op TMEM-deuropeningen en wordt geassocieerd met de verstoring van vasculaire strakke en aanhekings knooppunten. Dit type vasculaire permeabiliteit is van voorbijgaande aard en wordt gecontroleerd door het tripartiete TMEM-celcomplex, zoals hierboven beschreven5. De mogelijkheid om TMEM-geassocieerde vasculaire permeabiliteit te identifice…
The authors have nothing to disclose.
We willen de analytische Imaging Facility (AIF) bedanken in het Albert Einstein College of Medicine voor Imaging support. Dit werk werd gesteund door subsidies van de NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 en CA216248), de SIG 1S10OD019961-01, het Gruss-Lipper Biophotonics Center en zijn geïntegreerde beeldvormings programma, en Montefiore ‘ s Ruth L. Kirschstein T32 opleidings subsidie van chirurgen voor de studie van de tumor micro Environment (CA200561).
GSK schreef het manuscript samen, voerde Imaging uit voor figuur 1c en 3B, ontwikkelde een protocol voor de analyse van vaste weefsels en analyseerde en interpreteerde alle gegevens; Jmp schreef het manuscript samen en voerde de chirurgie en intravital Imaging uit voor figuur 1b, 2C en 3a; LB & AC voerde de operatie uit en intravital beeldvorming voor figuur 2b; RJ voerde de operatie uit en intravital beeldvorming voor Figuur 2a; JSC schreef het manuscript samen en analyseerde en interpreteerde alle gegevens; MHO schreef het manuscript samen en analyseerde en interpreteerde alle gegevens; en de voerde de operatie en intravital beeldvorming voor figuur 2D, co-schreef het manuscript, ontwikkelde vaste weefsel analyse en intravital Imaging protocollen, en geanalyseerd en geïnterpreteerd alle gegevens.
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) | Life Technologies Corporation | A-11034 | |
Anti-rat IgG (Alexa 647) | Life Technologies Corporation | A-21247 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Citrate | Eng Scientific Inc | 9770 | |
Cover Glass Slips | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
Cyanoacrylate Adhesive | Henkel Adhesive | 1647358 | |
DAPI | Perkin Elmer | FP1490 | |
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine | Sigma Aldrich | T1287 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
Endomucin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | |
Enrofloxacin | Bayer | 84753076 v-06/2015 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
Fish Skin Gelatin | Fisher Scientific | G7765 | |
Insulin Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
Isofluorane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
Matrigel | Corning | CB40234 | Artificial extracellular matrix |
Needle (30 G) | Becton Dickinson | 305128 | |
Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | PBS | |
Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | |
Pulse Oximeter | Kent Scientific | MouseOx | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
Quantum Dots | Life Technologies Corporation | Q21561MP | |
Rubber | McMaster Carr | 1310N14 | |
TMR (primary antibody) | Invitrogen | A6397 | |
Tween-20 | MP Biologicals | TWEEN201 | |
Xylene | Fisher Scientific | 184835 |