We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.
Carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE)-gebaseerde in vivo chemo tests kunnen gevoelige en nauwkeurige kwantificatie van CD8+ cytolytische T LYMFOCYTEN (CTL) reacties uitgelokt tegen tumor-en pathogeen-afgeleide peptiden. Zij bieden verscheidene voordelen over traditionele het doden analyses aan. Eerst, toestaan zij de controle van CTL-gemedieerde chemo in architecturaal intacte secundaire lymfeorganen, typisch in de milt. Ten tweede, ze zorgen voor mechanistische studies tijdens de priming, de effect-en Recall fasen van CTL Responses. Ten derde, ze bieden nuttige platforms voor vaccin/drug effectiviteit testen in een echt in vivo setting. Hier bieden wij een geoptimaliseerd protocol voor het onderzoek van gelijktijdige CTL reacties tegen meer dan een peptide epitope van een model tumor antigen (AG), namelijk Simian virus 40 (SV40)-gecodeerde grote T AG (T AG). Net als de meeste andere klinisch relevante tumor eiwitten, T AG havens veel potentieel immunogeen peptiden. Echter, slechts vier van deze peptiden induceren detecteerbare CTL reacties in C57BL/6 muizen. Deze antwoorden worden constant gerangschikt in een hiërarchische orde die op hun omvang wordt gebaseerd, die de basis voor TCD8 “immunodominance” in dit krachtige systeem vormt. Dienovereenkomstig, het grootste deel van de T AG-specifieke TCD8 reactie is gericht tegen een enkele immunodominant epitope terwijl de andere drie epitopes worden erkend en gereageerd op slechts zwak. Immunodominance compromissen de breedte van antitumorale TCD8 reacties en is als zodanig, door velen beschouwd als een belemmering voor een succesvolle vaccinatie tegen kanker. Daarom is het belangrijk om te begrijpen van de cellulaire en moleculaire factoren en mechanismen die dicteren of vorm TCD8 immunodominance. Het protocol beschrijven we hier is afgestemd op het onderzoek van dit fenomeen in de T AG immunisatie model, maar kan gemakkelijk worden gewijzigd en uitgebreid tot soortgelijke studies in andere tumor modellen. Wij bieden voorbeelden van hoe de impact van experimentele immunotherapeutische interventies kan worden gemeten met behulp van in vivo chemotherapie analyses.
Conventionele CD8+ t-cellen (tCD8) spelen belangrijke onderdelen in antikanker immuun toezicht. Ze werken voornamelijk in de hoedanigheid van cytolytische T lymfocyten (Ctl’s) die herkennen tumor-specifieke of-geassocieerde peptide antigenen (AGS) weergegeven binnen de gesloten spleet van de grote Histocompatibility complexe (MHC) klasse I moleculen. Volledig gewapend Ctl’s gebruiken hun chemo arsenaal om kwaadaardige cellen te vernietigen. Antikanker TCD8 kan worden gedetecteerd in de circulatie of zelfs binnen primaire en gemetastaseerde massa’s van vele kankerpatiënten en tumor-dragende dieren. Echter, ze zijn vaak anergic of uitgeput en niet aan kanker uit te roeien. Daarom zijn veel immunotherapeutische modaliteiten ontworpen om kanker TCD8 frequenties te verhogen en om hun functies te herstellen en te stimuleren.
De proteïnen van de tumor haven vele peptides, wat waarvan kan worden immunogeen en potentieel immunoprotective. Echter, kwantificeerbare TCD8 reacties worden uitgelokt met verschillende magnitudes tegen enkele peptiden alleen. Dit leidt tot een “immunodominance hiërarchie” onder TCD8 klonen1. Dienovereenkomstig, immunodominant (ID) TCD8 bezetten prominente hiërarchische rangen, die algemeen wordt beoordeeld door hun overvloed. In tegenstelling, TCD8 cellen waarvan t-cel receptor (TCR) is specifiek voor subdominante (SD) epitopes optreden in lagere frequenties. Wij en anderen hebben een aantal van de factoren die dicteren of vorm immunodominance in TCD8 reacties. Deze omvatten, onder andere, de wijze van AG presentatie aan naïef TCD8 (d.w.z., directe presentatie, dwars-presentatie, cross-dressing)2,3,4, het type van AG-presenterende cellen (APCs) deelnemen aanT CD8 activering5, de overvloed en stabiliteit van eiwittenAGS 6,7 en de efficiëntie en kinetiek van hun afbraak door proteasomes7,8, de relatieve selectiviteit van de vervoerder geassocieerd met AG verwerking (TAP) voor peptiden9, de affiniteit van de bevrijde peptiden voor mhc I moleculen9,10, de aanwezigheid, voorloper frequenties en TCR diversiteit van cognate tCD8 in t Cell zwembaden11,12,13, cross-concurrentie onder t-cellen voor de toegang tot APCs14,15, en de broeder capaciteit van tCD8 klonen16. Bovendien, TCD8 immunodominance is onderworpen aan immunoregulerende mechanismen bemiddeld door verschillende suppressor cel typen, zoals natuurlijk voorkomende regelgevende T (nTreg) cellen17, de cel oppervlakte co-remmende molecuul geprogrammeerd Death-1 (PD-1)16, en bepaalde intracellulaire enzymen zoals Indoleamine 2, 3-DIOXYGENASE (Ido)18 en de zoogdier doelstelling van rapamycine (mTOR)19. Het is belangrijk op te merken, echter, dat de bovenstaande factoren niet altijd volledig rekening houden met immunodominance.
Behalve de basis biologie van TCD8 immunodominance, heeft het onderzoek van dit intrigerende fenomeen belangrijke implicaties in kanker immunologie en immunotherapie. Ten eerste, een ID-status niet noodzakelijkerwijs verleent aan een bepaalde TCD8 kloon de mogelijkheid om tumor initiatie of progressie te voorkomen20. Of en hoe ID en SD TCD8 bijdragen aan antitumorale immuniteit kan afhankelijk zijn van het type en de omvang van de kwaadaardigheid en het experimentele systeem tewerkgesteld. Ten tweede wordt gedacht dat ID TCD8 klonen kan worden ‘ te zichtbaar ‘ om het immuunsysteem en dus meer vatbaar voor centrale en/of perifere tolerantiemechanismen16,21. Ten derde, heterogene tumoren kunnen bevatten neoplastische cellen die detectie te voorkomen door vele, zo niet de meeste, Ctl’s door het weergeven van slechts een smal spectrum van peptide: MHC-complexen. Onder deze omstandigheden, TCD8 reacties van onvoldoende breedte zijn waarschijnlijk een dergelijke tumorcellen veroorloven een overlevingsvoordeel, dus versterkende hun uitgroei22. Het is om de bovengenoemde redenen dat vele mening immunodominance als hindernis aan succesvolle TCD8-based inenting en therapie tegen kanker.
Inenting van C57BL/6 muizen met Simian virus 40 (SV40)-omgezette cellen die uitdrukken grote tumor AG (T AG) verstrekt een krachtig preklinisch systeem om TCD8 immunodominance te bestuderen. Dit model biedt verschillende voordelen. Eerst, is peptide epitopes van dit klinisch relevante oncoprotein goed-gekenmerkt in deze muis spanning23 (lijst 1). Ten tweede, T AG epitopes, die worden genoemd sites I, II/III, IV en V, trigger TCD8 reacties die consequent zijn gerangschikt in de volgende hiërarchische volgorde: site iv > > site I ≥ site II/III > ≫ site V. dienovereenkomstig, site IV-specifieke TCD8 Monteer de meest robuuste reactie op T AG. In tegenstelling, sites I en II/III zijn subdominante, en site V-specifieke TCD8 zijn minst overvloedig en meestal alleen detecteerbaar in het ontbreken van responsiviteit naar andere epitopes23,24. Ten derde, de T AG+ tumor Cell line gebruikt in het Protocol hierin beschreven, namelijk C57SV fibrosarcoom cellen, en die worden gebruikt in onze eerdere onderzoeken16,17,18,19 ,25,26, worden getransformeerd met subgenomische SV40 fragmenten25. Daarom zijn ze niet in staat te assembleren en release SV40 virionen die mogelijk kunnen infecteren host APCs. Bovendien zijn de C57SV cellen verstoken van klassieke costimulatoire moleculen zoals CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), en CD137 ligand (4-1BBL)16. De bovenstaande attributen maken deze lijnen ideaal voor onderzoek van in vivo TCD8 activering via cross-priming. Cross-priming is een belangrijke weg in het induceren van TCD8 reacties, vooral die gelanceerd tegen tumorcellen van niet-hematopoietische oorsprong die niet direct Prime naïeve T-cellen25.
Antitumorale TCD8 frequenties en/of functies kunnen worden gecontroleerd door MHC I Tetramer kleuring, intracellulaire kleuring voor de werking cytokines (bijv. interferon [IFN]-γ) of lytische moleculen (bijv. perforin), enzym-gebonden Immunospot (ELISPOT) assays en ex vivo chemo tests. Sinds hun oprichting in de jaren 199027,28, carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE)-gebaseerd in vivo doden tests hebben ingeschakeld evaluatie van chemo reacties bemiddeld door antivirale ctl’s29,30 , 31, antitumorale ctl’s16,32, Natural Killer (NK) cellen33, glycolipide-reactieve invariante Natural killer T (iNKT) cellen34, en reeds bestaande en de Novo donor-specifieke alloantibodies26. Daarom kunnen hun toepassingen van belang zijn voor een breed lezerspubliek, met inbegrip van maar niet beperkt tot onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van tumor immunologie en immunotherapie, anti-pathogeen immuniteit, en preventieve en therapeutische vaccin ontwerp.
Om de cel-gemedieerde chemo behandeling in typische scenario’s te beoordelen, twee populaties van naïeve splenocyten die ofwel een irrelevante AG of een cognate AG (s) worden aangeduid met twee verschillende doses van CFSE, gemengd in gelijke aantallen en geïnjecteerd in naïeve (controle) of moordenaar Cell-harboring muizen. De aanwezigheid/afwezigheid van elke doelpopulatie wordt vervolgens onderzocht door stromings Cytometry.
We hebben geoptimaliseerd en werkzaam in vivo doden assays in onze studies over immunodominance in zowel antivirale en antitumorale TCD8 reacties12,16,17. Hier bieden wij een gedetailleerd protocol voor de gelijktijdige beoordeling van ID en SD TCD8 reacties op t AG epitopes, die gemakkelijk kan worden vastgesteld voor soortgelijke onderzoeken in andere experimentele systemen. We bieden ook representatieve resultaten waaruit blijkt dat nTreg cel uitputting en PD-1 blokkade kan selectief verbeteren ID TCD8-en SD tCD8-geïnduceerde chemo, respectievelijk. Aan het eind zullen we bespreken meerdere voordelen van in vivo doden assays, alsmede enkele van hun inherente beperkingen.
CFSE-based in vivo chemo tests bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele doden assays zoals radioactieve chromium (51CR) release en colorimetrische lactaatdehydrogenase (LDH) release assays. Eerst, laten zij de controle van CTL functie binnen een architecturaal intact secundair lymfe orgaan toe.
Ten tweede, de specifieke doden van doelcellen in in vivo chemo tests weerspiegelt het absolute aantal van AG-specifieke TCD8, die meestal, maar niet altijd, ee…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door Canadese instituten van het onderzoek van de gezondheid (CIHR) verleent MOP-130465 en PJT-156295 aan SMMH. JC wordt gedeeltelijk gesteund door een koningin Elizabeth II gediplomeerde beurs in wetenschap en technologie van het ministerie van Ontario van opleiding, hogescholen en universiteiten. CEM was een ontvanger van een Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship (doctoraal) van natuurwetenschappen en Engineering Research Council van Canada (NSERC).
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) | Bio X Cell | BE0012 | |
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) | Bio X Cell | BE0146 | |
CFSE | Thermo Fisher Scientific | C34554 | |
DMEM (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Bioproducts | 080-150 | Heat-inactivate prior to use |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | 10 mM final concentration |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Stock is 100X |
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) | SouthernBiotech | 0116-01 | Isotype control |
Rat IgG1 (clone HRPN) | Bio X Cell | BE0088 | Isotype control |
Rat IgG1 (clone TNP6A7) | Bio X Cell | BP0290 | Isotype control |
Rat IgG2a (clone 2A3) | Bio X Cell | BP0089 | Isotype control |
RPMI 1640 (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM final concentration |