ونحن هنا وصف تدفق الخلوية التي تستند في الجسم الحيوي قتل الفحص الذي يتيح النظر في المناعية في الاستجابات اللمفاوية T السامة للخلايا (CTL) لنموذج مستضد الورم. ونحن نقدم أمثله علي كيفيه استخدام هذا الفحص الأنيق للدراسات الميكانيكية ولاختبار فعاليه المخدرات.
كاربوكسيفلوريسسين الناجحة استر (cfse)-مقرها في اختبارات الخلايا الحيوية تمكين الحساسية ودقه الكمية منCD8 + لحل T اللمفاويات (CTL) الاستجابات التي اثارتها ضد الببتيدات المشتقة من الورم والممرض. هم يقدمون عده فوائد علي تقليديه قتل اختبارات. أولا ، انها تسمح برصد السمية الخلوية بوساطة CTL داخل الاجهزه اللمفاوية الثانوية سليمه معماريا ، وعاده في الطحال. ثانيا ، انها تسمح للدراسات الميكانيكية خلال المراحل فتيله ، المستجيب والاستدعاء من الاستجابات CTL. ثالثا ، انها توفر منصات مفيده لاختبار فعاليه اللقاح/المخدرات في بيئة الجسم الخارجي حقا. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لفحص الاستجابات CTL المصاحبة ضد أكثر من واحد من مرضبه الببتيد من نموذج مستضد الورم (Ag) ، وهي الفيروس simian 40 (SV40)-ترميز كبير T Ag (T Ag). مثل معظم البروتينات السرطانية ذات الصلة سريريا, T Ag الموانئ العديد من الببتيدات المناعية المحتملة. ومع ذلك ، فقط أربعه الببتيدات هذه للحث علي الاستجابات CTL للكشف في C57BL/6 الفئران. يتم ترتيب هذه الاستجابات باستمرار في ترتيب هرمي استنادا إلى حجمها ، والذي يشكل الأساس ل TCD8 “المناعية” في هذا النظام القوي. ووفقا لذلك ، يتركز الجزء الأكبر من الاستجابة tCD8 الخاصة t Ag ضد واحده السمية المناعية في حين يتم التعرف علي الثلاثة الأخرى المربه والرد علي ضعيف فقط. المناعي يهدد اتساع الاستجابات المضادة للورم TCD8 وهو ، علي هذا النحو ، يعتبره الكثيرون عائقا امام نجاح التطعيم ضد السرطان. ولذلك ، فمن المهم ان نفهم العوامل الخلوية والجزيئية واليات التي تملي أو تشكل TCD8 امودومنيانسي. البروتوكول الذي وصفناه هنا مصمم خصيصا لتحقيق هذه الظاهرة في نموذج التمنيع T Ag ، ولكن يمكن تعديله بسهوله وتوسيعه ليشمل دراسات مماثله في نماذج الأورام الأخرى. ونحن نقدم أمثله عن كيفيه قياس تاثير التدخلات العلاجية المناعية التجريبية باستخدام في اختبارات الخلوية الحيوية.
التقليديةCD8 + t الخلايا (tCD8) تلعب أجزاء هامه في مراقبه المناعة المضادة للسرطان. انها تعمل في المقام الأول في قدره الخلايا اللمفاوية T لحل (ctls) التي تعترف الأورام الببتيد المرتبطة أو المقترنة (الحثالة) المعروضة داخل الشق المغلقة من مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (mhc) الفئة الاولي الجزيئات. CTLs المسلحة بالبالكامل استخدام ترسانتها السامة للخلايا لتدمير الخلايا الخبيثة. يمكن الكشف عن السرطان TCD8 في الدورة الدموية أو حتى داخل الجماهير الابتدائية والمنتشرة من العديد من مرضي السرطان والحيوانية الحاملة للورم. ومع ذلك ، فانها غالبا ما تكون أنجيك أو استنفدت وتفشل في القضاء علي السرطان. ولذلك ، تم تصميم العديد من طرائق العلاج المناعي لزيادة المضادة للسرطان TCD8 الترددات واستعاده وتعزيز وظائفها.
البروتينات السرطانية الميناء العديد من الببتيدات ، وبعضها يمكن ان تكون مناعية ويحتمل ان تكون مناعية. ومع ذلك ، يتم استخلاصها الاستجاباتCD8 T قابله للقياس الكمي مع احجام متفاوتة ضد الببتيدات قليله فقط. هذا يخلق “التسلسل الهرمي المناعي” بين TCD8 استنساخ1. وفقا لذلك ، المناعية (ID) TCD8 تحتل الرتب الهرمية البارزة ، والتي يتم الحكم عاده من قبل وفره بهم. وعلي النقيض من ذلك ، فان خلايا TCD8 التي تكون مستقبلات الخلايا التائية (TCR) الخاصة بها محدده للفوقية المهيمنة (SD) التي تحدث في ترددات اقل. وقد حددنا نحن وغيرنا بعض العوامل التي تملي أو تشكل المناعة في استجابات TCD8 . وتشمل هذه ، من بين أمور أخرى ، طريقه تقديم ag إلى السذاجة TCD8 (اي ، العرض المباشر ، عبر العرض ، عبر خلع الملابس)2،3،4، ونوع من الخلايا تقديم ag (apcs) المشاركة في التنشيط TCD8 5، وفره واستقرار البروتين الحثالة6،7 وكفاءه وحركيه تدهورها من قبل بروتياسميس7،8، و الانتقائية النسبية للناقل المرتبطة تجهيز Ag (الحنفية) ل الببتيدات9، وتقارب الببتيدات المحررة لجزيئات mhc I9،10، وجود ، والترددات السلائف وتنوع TCR مشابه tCD8 in t الخلية تجمعات11،12،13، عبر المنافسة بين الخلايا t للوصول إلى apcs14،15، وقدره الاشقاء من tCD8 استنساخ16. الاضافه إلى ذلك ، يتم إخضاع TCD8 المناعي إلى أليات المناعية بوساطة عده أنواع الخلايا المثبطة مثل التي تحدث بشكل طبيعي t (nTreg) الخلايا17، والخلية سطح مشترك المثبطة المبرمجة الموت-1 (PD-1)16، وبعض الانزيمات داخل الخلايا مثل indoleamine 2 ، 3-ديوكسيجيناسي (IDO)18 والهدف الثدييات من راباميسين (mtor)19. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان العوامل المذكورة أعلاه لا تمثل دائما بشكل كامل للمناعة.
وبصرف النظر عن البيولوجيا الاساسيه لل TCD8 المناعي ، فان فحص هذه الظاهرة المثيرة للاهتمام له اثار هامه في علم المناعة السرطانية والعلاج المناعي. أولا ، لا تمنح حاله المعرف بالضرورة القدرة علي منع بدء الورم أو التقدم فيه بالقياس إلى TCD8 . سواء وكيف ID و SD TCD8 المساهمة في المناعة انتيورم قد تكون معتمده علي نوع ومدي الأورام الخبيثة والنظام التجريبي المستخدمة. الثانية, ويعتقد ان معرف رCD8 استنساخ قد تكون ‘ مرئية جدا ‘ للجهاز المناعي التالي أكثر عرضه لليات التسامح المركزية و/أو المحيطي16,21. ثالثا ، قد تحتوي الأورام الميتوزي علي خلايا الأورام السرطانية التي تتجنب الكشف من قبل العديد ، ان لم يكن معظم ، CTLs من خلال عرض طيف ضيق من الببتيد: المجمعات MHC. في ظل هذه الظروف, TCD8 الردود من اتساع غير كافيه من المرجح ان تحمل مثل هذه الخلايا السرطانية ميزه البقاء علي قيد الحياة, التالي تحفيز نموها22. وللاسباب المذكورة أعلاه ان العديد من رؤية المناعية كعقبه لنجاح التلقيح القائم عليCD8T والعلاجات ضد السرطان.
تلقيح الفئران C57BL/6 مع الفيروس simian 40 (SV40)-الخلايا المتحولة التي تعبر عن الورم الكبير ag (t ag) يوفر نظام سريري قوي لدراسة TCD8 المناعي. هذا النموذج يقدم العديد من الفوائد. أولا ، وتتميز بشكل جيد في هذا الضغط الفار الببتيد من هذا البروتين oncoproteinه ذات الصلة سريريا ( الجدول1). الثانية ، T Ag المربية ، والتي تسمي المواقع الأول والثاني/الثالث والرابع والخامس ، والزناد TCD8 الردود التي يتم ترتيبها باستمرار في ترتيب التسلسل الهرمي التالي: الموقع الرابع > > موقع I ≥ الموقع الثاني/الثالث > > الموقع خامسا. جبل الاستجابة الأكثر قوه ل T Ag. وعلي النقيض من ذلك ، فان الموقعين الأول والثاني/الثالث مهيمنان ، والمواقع V الخاصة بالCD8 الخاصة هي اقل وفره وعاده ما تكون قابله للكشف فقط في غياب الاستجابة لغيرها من المرتوب23،24. ثالثا ، TAg + خط الخلايا السرطانية المستخدمة في البروتوكول الموصوف هنا ، وهي الخلايا الليفية C57SV ، وتلك المستخدمة في التحقيقات السابقة لدينا16،17،18،19 ,25,26, حولت مع [سوبجنومي] SV40 شظايا25. ولذلك ، فهي غير قادره علي تجميع والإفراج عن SV40 virions التي يحتمل ان تصيب APCs المضيف. الاضافه إلى ذلك ، C57SV الخلايا خاليه من جزيئات الكلاسيكية كوستيمولاتوري مثل CD80 (b7-1) ، CD86 (b7-2) ، و CD137 يجند (4-1bbl)16. السمات المذكورة أعلاه جعل هذه الخطوط مثاليه للفحص في الجسم الCD8 T تنشيط عبر فتيله. عبر فتيله هو المسار الرئيسي في حمل TCD8 الاستجابات ، وخاصه تلك التي أطلقت ضد الخلايا السرطانية من أصل غير الدم التي تفشل في الخلايا الاوليه الساذجة مباشره25.
ويمكن رصد الترددات المضادة للورم TCD8 و/أو وظائف من قبل mhc I تترامير تلطيخ ، تلطيخ داخل الخلايا للتوكسينات المستجيب (علي سبيل المثال ، مضادات التداخل [ifn]-γ) أو جزيئات الليتيك (علي سبيل المثال ، تثقيب) ، والانزيمات المرتبطة المناعية (elispot) والسابقين اختبارات الخلوية الفيفو. منذ بدايتها في 1990s27,28, كاربوكسيفلوريسسين الناجحة استر (cfse)-مقرها في الجسم الحيوي قتل اختبارات مكنت تقييم الاستجابات السامة للخلايا بوساطة ctls المضادة للفيروسات29,30 , 31، المضادة للورم ctls16،32، الطبيعية القاتلة (ناغورني كاراباخ) الخلايا33، glycolipid-الثابتة التفاعلية القاتل الطبيعي T (inkt) الخلايا34، والموجودة مسبقا والخاصة بالمانحين محدده الأجسام المضادة26. ولذلك ، فان تطبيقاتها يمكن ان تكون ذات فائده لقراء واسعه ، بما في ذلك ولكن لا تقتصر علي المحققين العاملين في مجالات المناعة الأورام والعلاج المناعي ، والمناعة المضادة للمرض ، وتصميم اللقاح الوقائي والعلاجي.
لتقييم الخلايا الخلوية بوساطة في السيناريوهات النموذجية ، يتم تسميه اثنين من السكان من الخلايا الطحال الساذجة التي تعرض اما Ag غير ذي صله أو Ag (s) المدرك مع جرعتين مختلفتين من CFSE ، مختلطة في اعداد متساوية وحقنها في ساذج (السيطرة) أو القاتل الفئران التي تاوي الخلايا. بعد ذلك يتم فحص وجود/غياب كل السكان المستهدفين عن طريق قياس التدفق الخلوي.
لدينا الأمثل والعاملين في الجسم الحيوي قتل الاختبارات في دراساتنا علي المناعية في كل من المضادة للفيروسات ومضادات الأورام TCD8 الاستجابات12,16,17. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتقييم في وقت واحد من الهوية و SD TCD8 الردود علي الملحقات t Ag ، والتي يمكن اعتمادها بسهوله لتحقيقات مماثله في النظم التجريبية الأخرى. كما نقدم نتائج تمثيليه تبين ان استنزاف الخلايا nTreg و PD-1 الحصار يمكن ان تعزز بشكل انتقائي ID TCD8-و SD tCD8المستحثة للخلايا ، علي التوالي. وفي النهاية ، سنناقش المزايا المتعددة لاختبارات القتل المجرية فضلا عن بعض القيود المتاصله فيها.
المستندة إلى CFSE في اختبارات الخلوية الحيوية تقدم العديد من المزايا علي اختبارات القتل التقليدية مثل الكروم المشعة (51Cr) الإفراج والقياس اللوني لاكتات نازعه (ldh) الإفراج عن الاختبارات. أولا ، انها تسمح برصد وظيفة CTL داخل الجهاز اللمفاوي الثانوي سليمه معماريا.
ثانيا ، ان ?…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) منح ممسحة-130465 و PJT-156295 إلى SMMH. ويدعم المعهد جزئيا منحه الملكة اليزابيث الثانية للدراسات العليا في العلوم والتكنولوجيا من وزاره التدريب والكليات والجامعات في اونتاريو. وكان جيم حاصلا علي منحه الدراسات العليا من العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) من الكسندر غراهام بيل كندا.
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) | Bio X Cell | BE0012 | |
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) | Bio X Cell | BE0146 | |
CFSE | Thermo Fisher Scientific | C34554 | |
DMEM (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Bioproducts | 080-150 | Heat-inactivate prior to use |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | 10 mM final concentration |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Stock is 100X |
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) | SouthernBiotech | 0116-01 | Isotype control |
Rat IgG1 (clone HRPN) | Bio X Cell | BE0088 | Isotype control |
Rat IgG1 (clone TNP6A7) | Bio X Cell | BP0290 | Isotype control |
Rat IgG2a (clone 2A3) | Bio X Cell | BP0089 | Isotype control |
RPMI 1640 (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM final concentration |