Изображений, обработки протокол для анализа распространения и размер кластера мембранных рецепторов по микроскопии флуоресцирования
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для одной частицы, отслеживания анализа изображений, что позволяет дать количественную оценку коэффициентов диффузии, типы движения и кластер размеров одной частицы, обнаруженных микроскопии флуоресцирования.
Abstract
Отслеживание на видео последовательности и задняя анализ их траекторий частиц в настоящее время является общей операцией во многих биологических исследованиях. С помощью анализа рецептор клеточной мембраны кластеры как модель, мы представляем подробный протокол для этой задачи анализа изображений, с помощью Matlab процедуры и Фиджи (ImageJ): 1) определить регионы интереса и дизайн масок, адаптированных для этих регионов; 2) отслеживать частицы в видео микроскопии флуоресцирования; 3) проанализируйте характеристики распространения и интенсивности выбранных треков. Количественный анализ коэффициентов диффузии, типы движения и размер кластера получены микроскопии флуоресцирования и обработки изображений обеспечивает ценный инструмент для объективно определить динамику частиц и последствия изменения условия окружающей среды. В этой статье мы представляем подробные протоколы для анализа этих функций. Метод, описанный здесь не только позволяет одной молекулы отслеживания обнаружения, но также автоматизирует Оценка параметров поперечной диффузии на клеточные мембраны, классифицирует тип траектории и позволяет полный анализ таким образом преодолеть трудности в количественном определении размера пятна по всей траектории в клеточной мембраны.
Introduction
Мембранных белков, встроенных в липидный бислой находятся в постоянном движении, за счет диффузии тепловой. Их динамика необходимо регулировать клеток ответов, как межмолекулярные взаимодействия позволяют образование комплексов, которые варьируются в размерах от мономеров олигомеров и повлиять на стабильность сигнализации комплексов. Таким образом, изучение механизмов контроля динамики белков является новый вызов в клеточной биологии, необходимо понять сигнальных путей и определить функции непредвиденные клеток.
Были разработаны некоторые оптические методы для изучения этих взаимодействий в живых клетках1. Среди них полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF), разработанная в начале 1980-х годов, позволяет изучения молекулярных взаимодействий на или вблизи мембраны клетки2. Для изучения динамических параметров мембранных белков траекторий полученных данных TIRF в живых клетках, требуется одна частица отслеживания метод (SPT). Хотя некоторые алгоритмы доступны для этого, мы в настоящее время использовать тех, опубликованной3 Jaqaman et al., что адрес неоднородности движения частиц в поле плотные частицы, связывая частицы между последовательными кадрами для подключения в результате трек сегменты в полной траектории (временные частиц исчезновение). Программное обеспечение захватывает частицы, объединение и разбиение что результат агрегации и диссоциации события3. Один из выходных данных этого программного обеспечения является обнаружение частиц по всей траектории, определяя их X и Y позиции в каждом кадре.
После обнаружения частиц, мы применяем различные алгоритмы для определения короткий слаборазвитость диффузии коэффициент (D1-4)4,5. Применяя анализ8 момент расширения спектра (MSS)6,7,или путем установки значения «альфа» регулировка среднеквадратичной перемещения (MSD) на кривой9мы также классифицировать частицы согласно Тип траектории.
Анализ пятно интенсивности флуоресценции изображения является общей целью для ученых в области10,11. Наиболее распространенными алгоритм, используемый является так называемый номер и яркость. Этот метод тем не менее не позволяет правильно по кадрам интенсивности обнаружения частиц в мобильных фракции. Таким образом, мы породили новый алгоритм для оценки этих частиц света–кадра и определить состояние их агрегирования. Как только координаты каждой частицы определяются с помощью программного обеспечения U-Track23, мы определяем его интенсивность в каждом фрейме над полным траектории, принимая также во внимание фона ячейки в каждом кадре. Это программное обеспечение предлагает различные возможности для определения интенсивности пятно и фона ячейки и, используя известные мономерные и димерной белков в качестве ссылки, вычисляет приблизительное количество белков в обнаруженных частиц (размер кластера).
В этой статье мы опишем тщательное руководство выполнение этих трех шагов: 1) обнаружения и отслеживания одной частицы вдоль видео микроскопии флуоресцирования, с помощью U-трек; 2) анализ коэффициент мгновенной диффузии (D1-4) из этих частиц и типа движения (замкнутых, бесплатно или режиссер) частиц с длиной траекторий по УВО; 3) измерения интенсивность пятно вдоль видео исправить предполагаемое фон флуоресценции для каждого пятна. Это позволяет Оценка размера кластера и определение Фотообесцвечивание шагов.
Использование этого протокола не требует специальных навыков и может быть выполнена в любой лаборатории с клеточной культуры, поток цитометрии и микроскопии. Протокол использует ImageJ или Фиджи (распределение ImageJ12), U-track3и некоторые ad hoc сделал процедуры (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-трек и специальных процедур пробегают Matlab, который может быть установлен в любой совместимый компьютер.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описан метод легко выполнять даже без каких-либо предыдущий опыт работы с Matlab. Однако Matlab процедуры требуют чрезвычайно точность с номенклатуры различных команд и локализация различных папок, используемых программой. В деле отслеживания процедура анализа (шаг 3), несколько параметров ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Карло Manzo и Мария Гарсия Parajo за их помощь и исходный код анализа коэффициент диффузии. Эта работа частично поддержали грантов от испанского министерства науки, инноваций и университетов (SAF 2017-82940-R) и программа RETICS Instituto de salud Карлоса III (RD12/0009/009 и RD16/0012/0006; МОЛО). COMFUTURO программы Фонд Генеральной CSIC поддерживаются LMM и СП.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
- Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
- Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).
