Summary

Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

Published: April 09, 2019
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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per singola particella monitoraggio analisi delle immagini che permette la valutazione quantitativa dei coefficenti di diffusione, tipi di movimento e cluster di dimensioni delle singole particelle rilevate mediante microscopia a fluorescenza.

Abstract

Monitoraggio su una sequenza video e l’analisi posteriore dei loro traiettorie delle particelle al giorno d’oggi sono un’operazione comune a molti studi biologici. Utilizzando l’analisi del ricevitore della membrana cellulare cluster come un modello, vi presentiamo un protocollo dettagliato per questa attività di analisi di immagine utilizzando Fiji (ImageJ) e routine di Matlab per: 1) definire le aree di interesse e progettare maschere adattate a queste regioni; 2) traccia le particelle in video microscopia di fluorescenza; 3) analizzare le caratteristiche di diffusione e l’intensità dei brani selezionati. I tipi di movimento e la dimensione dei cluster, analisi quantitativa dei coefficienti di diffusione ottenuta mediante microscopia a fluorescenza ed elaborazione di immagini fornisce un valido strumento per determinare oggettivamente particelle dinamiche e le conseguenze della modifica condizioni ambientali. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per l’analisi di queste caratteristiche. Il metodo descritto qui non solo permette la rilevazione di rilevamento di singola molecola, ma consente anche di automatizzare la stima dei parametri di diffusione laterale alla membrana delle cellule, classifica il tipo di traiettoria e consente analisi completa superando così il Difficoltà a quantificare la dimensione dello spot sulla sua intera traiettoria alla membrana delle cellule.

Introduction

Proteine di membrana incorporati nel bilayer del lipido sono in continuo movimento a causa di diffusione termica. Le dinamiche sono essenziali per regolare le risposte cellulari, come interazioni intermolecolari permettono la formazione di complessi che variano nel formato da monomeri di oligomeri e influenzare la stabilità di complessi di segnalazione. Chiarire i meccanismi che controllano la dinamica della proteina è dunque una nuova sfida in biologia cellulare, necessaria per comprendere le vie di trasduzione del segnale e per identificare le funzioni delle cellule imprevisti.

Alcuni metodi ottici sono stati sviluppati per lo studio di queste interazioni in vivo le cellule1. Tra questi, microscopia a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale, sviluppata nei primi anni 1980, permette lo studio delle interazioni molecolari o molto vicino alla membrana cellulare2. Per studiare i parametri dinamici di traiettorie di proteine di membrana ottenuti dai dati di TIRF in cellule viventi, una singola particella inseguimento del metodo (SPT) è richiesta. Anche se diversi algoritmi sono disponibili per questo, utilizziamo attualmente quelli pubblicati da Jaqaman et al.3 che indirizzo eterogeneità di movimento delle particelle in un campo di particelle dense collegando particelle tra fotogrammi consecutivi per collegare la traccia risultante segmenti in traiettorie complete (scomparsa temporanea delle particelle). Il software acquisisce la particella Unione e divisione di quel risultato da aggregazione e dissociazione eventi3. Uno dei dati di output di questo software è rilevamento delle particelle lungo l’intera traiettoria definendo le posizioni X e Y in ogni fotogramma.

Una volta che le particelle vengono rilevate, applichiamo diversi algoritmi per determinare l’intervallo breve diffusione coefficiente (D1-4)4,5. Applicando l’analisi di8 7,6,momento Scaling spettro (MSS) o inserendo il valore di ‘alpha’ di regolazione della cilindrata di Mean Square (MSD) alla curva9, classifichiamo anche le particelle secondo il tipo di traiettoria.

Analisi di spot intensità nelle immagini di fluorescenza sono un obiettivo condiviso per gli scienziati nel campo10,11. L’algoritmo più comune utilizzato è il cosiddetto numero e luminosità. Questo metodo tuttavia non consente rilevamento corretto frame-by-frame intensità in particelle nella frazione del mobile. Abbiamo, quindi, generato un nuovo algoritmo per valutare queste particelle intensità frame-by-frame e per determinare il loro stato di aggregazione. Una volta le coordinate di ogni particella vengono rilevate utilizzando U-Track2 software3, definiamo la sua intensità in ogni fotogramma sopra la traiettoria completa, tenendo conto anche lo sfondo della cella in ogni fotogramma. Questo software offre diverse possibilità per determinare l’intensità di spot e lo sfondo della cella e, utilizzando proteine note monomeriche e dimeriche come riferimenti, calcola il numero approssimativo delle proteine della particella rilevato (dimensione del cluster).

In questo articolo, descriviamo una guida attenta per eseguire questi tre passi: 1) rilevazione e monitoraggio delle singole particelle lungo un video di microscopia di fluorescenza usando U-traccia; 2) analizzare il coefficente di diffusione istantanea (D1-4) di quelle particelle e al tipo di movimento (confinato, gratuito o diretto) di particelle con lunghe traiettorie di MSS; 3) misurando l’intensità posto lungo il video rettificato da fluorescenza di fondo stimato per ogni spot. Questo consente di stima delle dimensioni cluster e identificazione dei passaggi photobleaching.

L’utilizzo di questo protocollo non richiede competenze specialistiche e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con coltura cellulare, strutture di microscopia e citometria di flusso. Il protocollo utilizza ImageJ o Fiji (una distribuzione di ImageJ12), U-traccia3e alcune routine di hoc fatta di annuncio (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-traccia e ad hoc routine eseguite su Matlab che può essere installato in qualsiasi computer compatibile.

Protocol

1. preparazione dei campioni biologici Crescere le cellule Jurkat in RPMI 1640 supplementato con 10% FCS, NaPyr e L-Glutammina (RPMI completo). Cellule di Electroporate Jurkat (20 x 106 cellule/400 µ l di RPMI 1640 con 10% FCS) con un vettore di ricevitore di chemokine GFP-etichettata monomerico (CXCR4-AcGFP, 20 μg) per consentire il rilevamento utilizzando la microscopia a fluorescenza.Nota: È possibile utilizzare altre proteine fluorescenti monomerici come mCherry, mScarlet,…

Representative Results

L’utilizzo di questo protocollo consente il rilevamento automatizzato delle particelle rilevato nel film di microscopia di fluorescenza e l’analisi delle loro caratteristiche dinamiche. Inizialmente, le cellule transfected con la proteina fluorescente-accoppiato di cui tenere traccia. Il livello appropriato di recettori presenta sulla superficie delle cellule che permette che SPT è ottenuta dalla cella ordinamento (Figura 1). Celle selezionate vengono analiz…

Discussion

Il metodo descritto è facile da eseguire anche senza avere alcuna precedente esperienza di lavoro con Matlab. Tuttavia, la routine di Matlab estremamente richiedono precisione con la nomenclatura dei comandi diversi e la localizzazione delle diverse cartelle impiegato dal programma. Di rilevamento routine di analisi (passaggio 3), più parametri possono essere modificati. La finestra “Impostazione gaussiana-miscela modello raccordo” (punto 3.8) controlla come U-traccia rileverà singole particelle sul video. Questo vien…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati a Carlo Manzo e Maria García Parajo per la loro guida e il codice sorgente dell’analisi del coefficiente di diffusione. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal Ministero spagnolo della scienza, innovazione e Università (SAF 2017-82940-R) e il programma RETICS dell’Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 e RD16/0012/0006; RIER). LMM e JV sono supportati dal programma COMFUTURO del CSIC Fondazione generale.

Materials

Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

References

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
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Cite This Article
Sorzano, C. O. S., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

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