Um novo modelo Enteroid epitelial humana de enterocolite necrosante
Summary
Enteroids estão emergindo como um novo modelo no estudo de doenças humanas. O protocolo descreve como simular um modelo enteroid de humano enterocolite necrosante usando lipopolissacarídeo (LPS) tratamento do enteroids gerados a partir de tecido neonatal. Enteroids coletados demonstram alterações inflamatórias parecido com aqueles vistos em enterocolite necrosante humana.
Abstract
Enterocolite necrosante (NEC) é uma doença devastadora de recém-nascidos. É caracterizada por várias alterações fisiopatológicas no epitélio intestinal humana, levando ao aumento da permeabilidade intestinal, prejudicada a restituição e aumentou a morte celular. Embora existam vários modelos animais de NEC, resposta a lesões e intervenções terapêuticas pode ser altamente variável entre as espécies. Além disso, é eticamente desafiante para estudar a fisiopatologia da doença ou novos agentes terapêuticos diretamente em seres humanos, especialmente crianças. Portanto, é altamente desejável para desenvolver um novo modelo de NEC usando tecido humano. Enteroids são organoids 3-dimensional derivado de células epiteliais intestinais. Eles são ideais para o estudo das interacções fisiológicas complexas, sinalização celular e defesa do hospedeiro-patógeno. Este manuscrito, descrevemos um protocolo que enteroids de culturas humanas depois isolar células-tronco intestinais de pacientes submetidos à ressecção intestinal. As células da cripta são cultivadas em meios que contêm fatores de crescimento que estimulam a diferenciação a várias nativo de tipos de célula do epitélio intestinal humano. Estas células são cultivadas em uma mistura sintética, colágenas de proteínas que servem como um andaime, imitando a extracelular da membrana basal. Como resultado, enteroids desenvolver polaridade apical-basolateral. Co-administração de lipopolissacarídeo (LPS) em mídia provoca uma resposta inflamatória no enteroids, levando a histológica, genética e alterações de expressão de proteínas semelhantes aos observados em humano NEC. Um modelo experimental de NEC usando tecido humano pode fornecer uma plataforma mais precisa para drogas e tratamento de teste antes de testes em humanos, como nós nos esforçamos para identificar uma cura para esta doença.
Introduction
Enteroids humanas são um ex vivo sistema de cultura 3-dimensional gerado a partir de células-tronco isoladas de criptas intestinais de amostras de tecido intestinal humana. Este modelo inovador foi pioneira por Hans Clevers et al. em 2007, após a descoberta de células-tronco Lgr5 + em criptas do intestino delgado em ratos1. Seu trabalho lançou as bases para o estabelecimento de um ex vivo cultura epitelial intestinal de vários tipos de células que podem ser passadas sem alterações significativas de genética ou fisiológica2. Desde essa descoberta, enteroids têm sido usados como um novo modelo para o estudo da fisiologia digestiva normal e da fisiopatologia de doenças intestinais como a doença inflamatória intestinal, interações patógeno-hospedeiro e medicina regenerativa2.
O uso de enteroids como um ex vivo de modelo para o estudo da fisiopatologia intestinal tem várias vantagens sobre técnicas alternativas. Há várias décadas, modelos animais e linhas celulares de câncer-derivado intestinal imortalizado tem sido costumava estudar fisiologia intestinal3,4,5. Culturas de célula única não representam a diversidade de tipos de células presentes no epitélio intestinal normal, assim, falta uma célula para outra-conversas cruzadas e segmento-especificidade na expressão da proteína, sinalização e doença induzida por patógeno6. Células-tronco em enteroids diferenciar em principais tipos de células epiteliais como enterócitos, células de Paneth, células de goblet, células enteroendócrina e mais3. Eles apresentam polaridade, realizar as funções de transporte epitelial e permitam a especificidade de segmento intestinal6. Desde que enteroids pode recapitular os vários tipos de células do epitélio intestinal humano, eles são capazes de superar essa limitação reconhecida de sistemas baseados em células de câncer. Ao longo do tempo, derivados de linhagens celulares são subcloned e evoluem para apresentam maior diversidade na proteína expressão e localização3. Pelo contrário, enteroids podem ser passadas sem alterações significativas de genética ou fisiológica2. Embora existam vários modelos animais para o NEC, resposta a lesões e intervenções terapêuticas pode ser altamente variável entre as espécies. Como resultado dessas limitações, derivada de modelos animais de terapêutica falham 90% do tempo quando testado em ensaios em humanos devido a diferenças na toxicidade ou eficácia3. Enteroids servir como modelos pré-clínicos promissoras que podem superar estas deficiências, levando a um melhor entendimento da fisiopatologia intestinal complexa e, portanto, mais bem sucedidas e rentáveis inovações terapêuticas. Há também evidências recentes que a idade do tecido que um enteroid é gerada a partir permanece biologicamente importantes7. Isto é um detalhe especialmente importante para nosso modelo desde enteroids são gerados a partir de tecido neonatal, mantendo assim a relevância fisiológica para portadores de NEC.
O utilitário de enteroids como modelos de doenças humanas continua a expandir-se, na esperança de encontrar curas para condições severas e penetrante. Enterocolite necrosante (NEC) é uma doença intestinal devastadora dos neonatos, caracterizada por necrose intestinal e frequentemente leva à perfuração da parede do intestino, septicemia e morte8. Devido à complexa e multifatorial fisiopatologia da NEC, o mecanismo exato da doença ainda não foi totalmente elucidado; no entanto, aumento da permeabilidade intestinal tem sido claramente implicado no processo doença8. Dado que o estudo da NEC e potenciais agentes terapêuticos é eticamente desafiador em seres humanos, especialmente crianças, que é altamente desejável utilizar um modelo de enteroid biologicamente relevantes da NEC usando tecido humano neonatal. Até agora, enteroids tem um papel limitado no estudo da NEC. Este protocolo descreve o uso de enteroids, derivado de amostras de tecido intestinal humana, como um romance ex vivo de modelo para o estudo da enterocolite necrosante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este romance ex vivo enteroid intestinal humano modelo serve como um método útil para o estudo da disfunção da barreira intestinal em (NEC) de enterocolite necrosante. Os métodos de processamento de enteroid aqui apresentados foram adaptados do trabalho anterior de DRS Misty Good, Michael Helmrath e do Jason Wertheim11,de10,12.
Detalhes em torno de toda a coleção de tecido e sincronismo de isol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto de saúde Instituto Nacional de Diabetes, digestivo e renal doença Grant (K08DK106450) e o Jay Grosfeld prêmio da associação americana de cirurgia pediátrica para C.J.H.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
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