Summary

Neuartige menschlichen epitheliale Enteroid Modellcharakter für die nekrotisierende Enterokolitis

Published: April 10, 2019
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Summary

Enteroids entstehen als neuartige Modell in der Studie der menschlichen Krankheit. Das Protokoll beschreibt, wie eine Enteroid Modell der menschlichen nekrotisierenden Enterokolitis mit Lipopolysaccharid (LPS) Behandlung von Enteroids generiert aus neonatalen Gewebe zu simulieren. Gesammelte Enteroids zeigen entzündliche Veränderungen, wie Sie die in menschlichen nekrotisierenden Enterokolitis gesehen.

Abstract

Nekrotisierende Enterokolitis ist (NEC) eine verheerende Erkrankung des Neugeborenen. Es zeichnet sich durch mehrere pathophysiologische Veränderungen in der menschlichen Darmepithel, führt zu erhöhte intestinale Permeabilität, Rückgabe beeinträchtigt, und erhöhte Zelltod. Zwar gibt es zahlreiche Tiermodelle der NEC, möglicherweise als Reaktion auf Verletzungen und therapeutische Interventionen sehr variabel zwischen den Arten. Darüber hinaus ist es ethisch schwierigen Krankheit Pathophysiologie oder neuartige Therapeutika direkt am Menschen, besonders Kinder zu studieren. Daher ist es äußerst wünschenswert, ein neuartiges Modell von NEC mit menschlichem Gewebe zu entwickeln. Enteroids sind 3-dimensionale Organellen von intestinalen Epithelzellen abgeleitet. Sie sind ideal für die Untersuchung von komplexen physiologischen Wechselwirkungen, Zelle signalisieren und Wirt-Pathogen-Verteidigung. In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll, dass Kulturen menschlichen Enteroids nach intestinale Stammzellen von Patienten, die eine Darmresektion zu isolieren. Die Krypta Zellen sind kultiviert, in Medien, die Wachstumsfaktoren, die die Differenzierung in die verschiedenen Zelle Arten aus der menschlichen intestinalen Epithel zu fördern. Diese Zellen wachsen in einer synthetischen, kollagene Mischung von Proteinen, die als ein Gerüst, imitiert die extrazelluläre Basalmembran dienen. So entstehen Enteroids apikalen basolateralen Polarität. Die gleichzeitige Gabe von Lipopolysaccharid (LPS) in den Medien verursacht eine entzündliche Reaktion in den Enteroids, führt zu histologischen, genetische und Protein Ausdruck Änderungen ähnlich denen im menschlichen NEC. Ein experimentelles Modell von NEC mit menschlichem Gewebe kann eine genauere Plattform für Droge und Behandlung vor der Studien am Menschen, bieten, wenn wir uns bemühen, eine Heilung für diese Krankheit zu identifizieren.

Introduction

Menschliche Enteroids sind eine Ex Vivo 3-dimensionale Kultursystem aus Stammzellen isoliert vom Darm Krypten von menschlichen Darm Gewebeproben erzeugt. Dieses bahnbrechende Modell wurde von Hans Clevers Et Al. erstmals in 2007 nach der Entdeckung der Lgr5 + Stammzellen in den Krypten des Dünndarms in Mäuse1. Ihrer Arbeit den Grundstein für die Gründung einer Ex Vivo intestinalen epithelialen Kultur mehrere Zelltypen, die ohne genetische oder physiologische Veränderungen2passagiert werden könnte. Seit dieser Entdeckung wurden Enteroids als ein neuartiges Modell zur normalen Verdauungs-Physiologie und Pathophysiologie von Darmerkrankungen wie die entzündlichen Darmerkrankungen, Wirt-Pathogen Interaktionen und regenerative Medizin2zu studieren.

Die Verwendung von Enteroids als Ex Vivo Modell für die Untersuchung der Darm Pathophysiologie hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Techniken. Seit mehreren Jahrzehnten wurden Tiermodelle und verewigt Darm Krebs-abgeleitete Zellinien zur intestinalen Physiologie3,4,5zu studieren. Einzellige Kulturen repräsentieren nicht die Vielfalt der Zelltypen im normalen Darmepithel, dadurch fehlt Übersprechen von Zelle zu Zelle und Segment-Spezifität in Protein-Expression, Signalisierung und Pathogen-induzierte Krankheit6. Stammzellen in Enteroids differenzieren in die Major Epithelzelle Typen z. B. Enterozyten, Paneth-Zellen, Becherzellen, Enteroendocrine Zellen und mehr3. Sie weisen Polarität, epithelialen Transport-Funktionen durchführen und Darm Segment Spezifität6ermöglichen. Da Enteroids mehrere Zelltypen des menschlichen Darmepithel zusammenfassen können, sind sie in der Lage, diese anerkannten Einschränkung von Krebs Zelle-basierten Systemen zu überwinden. Im Laufe der Zeit Derivate von Zelllinien sind subcloned und weiterentwickelt werden, um größere Vielfalt in Protein-Expression und Lokalisation3aufweisen. Im Gegenteil, können Enteroids ohne genetische oder physiologische Veränderungen2passagiert werden. Obwohl zahlreiche Tiermodelle für NEC vorhanden sind, möglicherweise als Reaktion auf Verletzungen und therapeutische Interventionen sehr variabel zwischen den Arten. Aufgrund dieser Beschränkungen Scheitern Therapeutika abgeleitet aus Tiermodellen 90 % der Zeit als in Studien am Menschen aufgrund unterschiedlicher Toxizität oder Wirksamkeit3getestet. Enteroids dienen als vielversprechende präklinischen Modellen, die diese Mängel überwinden können, führt zu einem besseren Verständnis der komplexen Pathophysiologie Darm und damit erfolgreiche und kostengünstige therapeutische Innovationen. Es gibt auch neuere Erkenntnisse, die das Alter des Gewebes, die eine Enteroid entsteht aus biologisch wichtigen7bleibt. Dies ist ein besonders wichtiges Detail für unser Modell, da Enteroids von Neugeborenen Gewebe, dadurch Erhalt physiologische Relevanz für Patienten mit NEC generiert werden.

Das Enteroids-Dienstprogramm als Modelle für menschliche Krankheiten expandiert weiter in der Hoffnung, Kuren, schwere und durchdringende Bedingungen. Nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist eine verheerende Darm Erkrankung des Neugeborenen gekennzeichnet durch intestinale Nekrose und führt häufig zur Perforation der Darmwand, Sepsis und Tod8. Aufgrund der komplexen und multifaktorielle Pathophysiologie der NEC hat der genaue Mechanismus der Krankheit noch nicht vollständig geklärt; jedoch hat deutlich erhöhte intestinale Permeabilität in der Krankheit Prozess8verwickelt. Da die Studie von NEC und potenzielle Therapeutika ist ethisch anspruchsvollen am Menschen, besonders Kinder, es ist höchst wünschenswert, eine biologisch relevante Enteroid Modell von NEC mit menschlichen Neugeborenen Gewebe zu nutzen. Bisher haben Enteroids nur eine begrenzte Rolle in der Studie von NEC. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Enteroids abgeleitet vom menschlichen Darm Gewebeproben als Roman ex Vivo Modell für die Untersuchung von nekrotisierende Enterokolitis.

Protocol

Institutionelle Review Board Genehmigung war (IRB #2013-15152) für die Sammlung von Gewebeproben von Patienten mit Darmresektion an Ann und Robert H. Lurie Children es Hospital of Chicago, Chicago, IL. Alle Protokolle wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien und Vorschriften für menschliches Wohlergehen durchgeführt. Schriftliche Zustimmung der Eltern fundierter war erforderlich und vor der Probenentnahme in allen Fällen erhalten. (1) Reagenz Vorbereitun…

Representative Results

Unmittelbar nach der Beschichtung erscheinen die frisch isolierten Darm Krypten als längliche Stangen. Innerhalb von Stunden nimmt die Enteroid auf ein rundes aussehen (Abbildung 1(ein). In den nächsten Tagen startet die Enteroids Kugeln bilden, wie in Abbildung 1bzu sehen. Angehende sollte zwischen 5 bis 10 Tagen (Abbildung 1c) und Enteroid Sammlu…

Discussion

Dieser Roman ex Vivo menschlichen Darm Enteroid Modell dient als eine nützliche Methode für die Studie der Darmbarriere Dysfunktion bei nekrotisierende Enterokolitis (NEC). Die Enteroid Verarbeitungsmethoden, die hier vorgestellt wurden von der früheren Arbeit von DRS. Misty Good, Michael Helmrath und Jason Wertheim10,11,12angepasst.

Details rund um das ganze Gewebe Sammlung und Timing der Krypta I…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das nationale Institut für Gesundheit Institut für Diabetes und Magen-Darm und Nieren Krankheit Grant (K08DK106450) und Jay Grosfeld Award von der American Pediatric Surgical Association, C.J.H.

Materials

4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

References

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Cite This Article
Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

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