Burada, biz üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji, titresi ve adeno ilişkili virüs vektörlerin kalite kontrol toplu işlemleri açıklanmaktadır. Bir vektör hazırlık ile yüksek-titresi elde etmek kullanýcýnýn (≥1 x 1013 vektör genleri/mL) ve yüksek saflıkta, vitro veya vivo içinde kullanıma hazır.
Adeno ilişkili virüs (AAVs) dayalı gen teslim araçlardır gen terapisi uygulamaları da dahil olmak üzere transgenes teslim edilmek üzere merkezi sinir sistemi (MSS), popüler bir seçim. AAV vektörleridir olmayan çoğaltılıyor, güçlü-e doğru bölme ve bölme hücreleri enfekte ve uzun vadeli transgene ifade sağlar. Önemlisi, bazı serotipleri, yeni açıklanan PHP gibi. B, kan-beyin-bariyer (BBB) hayvan modellerinde çapraz olabilir sistemik teslim takip. AAV vektörel çizimler verimli laboratuvarda üretilebilir. Ancak, sağlam ve tekrarlanabilir AAV vektörleri ile yeterli saflık düzeyleri ve titresi değerleri vivo içinde uygulamaları için yüksek almak için gerekli iletişim kurallarıdır. Bu iletişim kuralı bir iodixanol degrade arıtma stratejisi dayalı AAV vektör üretim için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji açıklar. İodixanol arıtma yöntemi dizi-in yüksek-titresi AAV vektörel çizimler yüksek saflık, diğer arıtma yöntemleri karşılaştırıldığında elde etmek için uygundur. Ayrıca, şu anda açıklanan diğer yöntemlerden daha genellikle daha hızlı iletişim kuralıdır. Buna ek olarak, nicel bir polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)-tabanlı strateji vektör toplu saflığı belirlemek bir hızlı ve doğru belirlenmesi vektör titresi yanı sıra bir gümüş boyama yöntemi için açıklanmıştır. Son olarak, sistemik yönetim AAV-php takip MSS, gen teslimat temsilcisi sonuçları. B, sunulmaktadır. Bu sonuçlar bu makalede açıklanan protokolleri kullanarak tüm Labs’de mümkün olmalıdır.
Son 30 yılda, vahşi tipli AAVs CNS1,2,3,4içine gen transferi için son derece yararlı araçlar olduğu kanıtlanmıştır rekombinant AAV vektörler oluşturmak için tasarlanmış, 5,6 ve gen terapisi (FDA ve EMA onaylanmış tedaviler de dahil olmak üzere) hastalığı4,7‘ ye yaklaşıyor. MSS kullanımda için Uygunluk Sigara bölen, sonrası Mitotik hücre bulaştırmak, genellikle CNS8‘ bulunan yeteneğini büyük ölçüde türetilmiştir. Ancak, AAV tabanlı vektörel çizimler de diğer viral vektörler7‘göre daha hafif bir immün yanıt alabilme ise uzun vadeli bir ifade herhangi bir verilen terapötik transgene4,9 izin vermenin avantajına sahip, 8,10,11,12.
Herhangi bir AAV vektör ana unsurları genom ve kapsid vardır. Vahşi tipli AAVs tek iplikçikli (ss) DNA virüsleri ile genom yaklaşık 5 kilobases (kb)13. Rekombinant AAV vektörel çizimler üretimi için temsilcisi ile kap gen (genom çoğaltma ve viral kapsid montajı için gerekli) vahşi tipi AAV genom silinir ve içinde transiçin oda bırakarak, sağlanan bir transgene14,15içeren ifade kaset. Bu çoğaltma ve3,10,14paketleme için temel olarak ters terminal tekrar dizileri (ITRs) özgün viral genom kopyası yalnızca tutulan bir AAV vektör öğelerdir. AAV vektörel çizimler transgene ifade geliştirmek için tasarlanmış; ITRs biri bir mutasyon etkili tamamlayıcı DNA strand3,7,15nesil sağlayan bir saç tokası döngü oluşumuna yol açar. İkinci-strand sentez AAVs önemli ölçüde transgene ifadesi düzeyi ve hızını artırarak, geleneksel yaşam döngüsünde tipik gereksinimini atlar bir öz-tamamlayıcı (sc) genom olarak adlandırdığı bu yapılandırma büyük avantajı olduğunu 1. Bununla birlikte, bir scAAV genom kullanarak vektör kargo kapasitesi yaklaşık 2,4 KB azaltır. Bu transgene dizileri yanı sıra Rehberleri veya mikroRNA bağlayıcı siteleri, ifade belirli hücre türleri16sınırlamak için gibi herhangi bir düzenleme dizileri içerir.
AAV kapsid vektör-konak hücre etkileşim belirler ve bir ölçüde de transgene ifade belirli konumlara sınırlamak için yararlanılabilir AAV serotip için hücre türü veya doku tropism confers. Diğerleri rekombinant yaklaşımlar (yani, PHP. aracılığıyla laboratuarlarında üretildi, ancak birkaç AAV serotipleri doğada bulunur B). Buna ek olarak, bazı capsids bestow da sistemik yönetim sonra transgenes MSS boyunca teslimini sonuçlanan BBB, çapraz yeteneği gibi diğer yararlı özellikleri. Bu AAV9, yanı sıra son zamanlarda açıklanan PHP için gösterilmiştir. B kapsid17. Sonuç olarak, bu serotipleri nörodejeneratif hastalıkları1,17,18için yeni gen terapisi yaklaşımlar için özellikle alakalı olacak şekilde kanıtlamaktadır.
Bu iletişim kuralının amacı AAV vektörler yüksek titresi ve saflık ile küçük ölçekli üretim için uygun maliyetli bir yöntem tarif etmektir. Her ne kadar burada sunulan sonuçlar PHP kullanın. B kapsid ve scAAV ifade kaset, protokol birkaç AAV vektör serotipleri ve genom yapılandırmaları, en fazla deneysel esneklik sağlayan üretimi için uygundur. Ancak, vektör verim ve son saflık seçilen serotip bağlı olarak değişebilir.
Protokolün kendisi klasik tri-transfection yöntem viral vektör üretim için bir türevi ve bir iodixanol degrade kullanım için vektör hangi sezyum klorür (CsCl) degradeler, klasik kullanımı ile karşılaştırıldığında olmuştur temizlik, birleştirmek AAV vektörel çizimler daha zaman verimli bir şekilde19,20,21daha yüksek saflık üretmek için bildirilen.
Transfection, arıtma ve toplama adımları iyi laboratuar uygulaması (GLP) göre yapılması için viral vektör çalışma için dekor doku kültürü Laboratuvarında yöneliktir. Her görev viral vektör üretim ile ilgili ilgili yerel ve ulusal mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmesi ve kullanmak gerekiyor. Laminar akış başlık altında ve steril koşullarda çalışma yapılmalıdır. Vektör tesis içinde ek olarak normal doku kültürü laboratuar önlüğünü bir laboratuar önlüğü giymek tavsiye edilir. Ayrıca, Çift kişilik bir çift eldiven yanı sıra plastik bütünleşik, her zaman giyilmelidir.
Önce vektör üretim başlangıç sağlamak tüm gerekli ekipman ve plazmid bulunmaktadır. 1) pCapsid plazmid çoğaltma için yani Rep78, Rep68, Rep52 ve Rep40, gerekli dört yapısal olmayan protein kodlayan temsilcisi gen ve üç yapısal kapsid protein, yani VP1, VP2 ve VP3 kodlayan kap gen içerir. 2) pHelper plazmid kolaylaştırmak AAV üretim HEK293T hücrelerdeki genler E4, E2Ave VA adenovirus, üzerinden içerir. 3) pTransgene plazmid tarafından iki ITRs çevrili transgene ifade kaset içerir. Bu Plasmid’ler sentezlenmiş de novo dizileri kullanılabilir çevrimiçi22kullanarak laboratuvar olabilir. De novoyapılan plazmid için özellikle roman transgenes, içeren sıralama, transgene ve ITRs doğru olduğundan emin olmak için gereklidir. Alternatif olarak, hazır plazmid doğrudan online plazmid depoları elde edilebilir. Gerektiğinde, plazmid çoğaltılabilir ve standart kitleri kullanarak üreticinin yönergeleri23göre saf.
Vektör titresi ve saflık vektör iletim yeteneği olumsuz yönde etkilenebilir. Ek protokolleri üretilen vektör niteliğini değerlendirmek için sağlanır. Son vektörel çizimler CNS hücre işlevi vitro ve in vivo uygulamalarında çalışmaları yararlı olacaktır.
Rekombinant AAV vektörel çizimler üretimi burada kullandığı malzeme ve ekipman çoğu Moleküler Biyoloji Laboratuvarları ve hücre kültür imkanları için ortak nitelendirdi. Vitro ve in vivo uygulamaları bir dizi birden çok hücre ve doku türü hedeflenecek kullanılan saf, preklinik sınıf AAV vektörel çizimler elde etmek kullanıcı sağlar. Bu iletişim kuralı, (yani, CsCl tabanlı arıtma), diğerlerine göre en büyük avantajlarından biri gerekli kısa çalışma zamanı. Kullanıma hazır AAV elde edilebilecek en fazla HEK293T hücrelerinin ilk transfection 6 işgünü içinde vektörleridir.
Çeşitli faktörler son verim veya AAV vektör kalitesini olumsuz etkileyebilir. Zavallı transfection verimliliği düşük viral verim33için ana nedenlerinden biri. Önemli bir tavsiye daha–dan 20 kere pasajlı değil ve bir hücre izdiham 90 %’den büyük transfection21anda var mı HEK293T hücreleri kullanılır. Ayrıca, seçilen transfection yöntemi sonuçları üzerinde büyük bir etkisi vardır. Bu iletişim kuralı PEI kullanımına dayanır. PEI eksojen DNA hücre çekirdeği kompleksleri polimer ve nükleik asit, hücre ve ticareti yoluyla endosomes34tarafından alınır polyplexes olarak bilinen nesil aracılığıyla teslim alma olanağı katyonik bir polimerdir. PEI tabanlı transfection, kalsiyum fosfat35ile DNA’ın yağış Co gibi diğer yaygın olarak kullanılan yöntemlerin aksine gerçekleştirmek için hızlı ve kolay. Ayrıca, PEI tabanlı transfection katyonik lipidler ve mıknatıs-aracılı transfection36kullanımı gibi yeni tanıtılan diğer yöntemlere göre çok daha ucuz.
Arıtma strateji protokolünde önemli bir rol oynar. Diğer yöntemlerine göre iodixanol tabanlı purifications boş viral parçacıkların (% 20)20daha yüksek bir yüzdesi içeren eğilimindedir. Bu, bir dereceye kadar gerçeği iodixanol tabanlı arıtma rutin AAV vektör hazırlıkları az 100 bir parçacık infektivite oranı ile sonuçları ile dengeleniyor. Bu parçacık infektivite önemli kaybı bildirilen37olduğu geleneksel CsCl tabanlı yordamlara ile karşılaştırıldığında önemli bir gelişme gösterir. AAV vektörel çizimler arındırmak için başka bir ortak alternatif Kromatografi dayalı saflaştırma yöntemidir. Ancak, bu yöntem özel bir sütunda kullanılan her vektör kapsid için gerekli olan önemli dezavantajı vardır: AAV2 heparin sütunları kullanarak klasik izole olmakla birlikte, örneğin, bu yöntemi AAV4 ve AAV5, hangi heparin bağlama sahip olmayan çalışmıyor onların capsids38sitelerinde. Kromatografi arıtma aynı zamanda pahalı olduğunu göz önünde bulundurursak, arıtma iodixanol tabanlı genellikle daha yüksek kaliteli toplu işlemleri AAV vektörlerin tarihinde bir küçük ölçekli33,39, üretmek istediğiniz laboratuarlar için uygundur 40. ancak, son verim ve vektör saflığı en üst düzeye çıkarmak için aşırı kaygı iodixanol degradeler yaparken gereklidir. Çeşitli iodixanol kesirler olan ucu tüp duvarına dokunmadan steril bir Pasteur pipet kullanarak ultrasantrifüj tüp aktarılması gerektiğini: iodixanol ihraç pipet yavaş yavaş ve sürekli olarak. Vektör parçacıklar % 40 iodixanol katmanında biriktikçe, bakım degrade arabirimleri20rmay sağlamak için alınması gerekiyor. Son olarak, vektör içeren kesir bir göstergesi 20 G. değil daha büyük bir paslanmaz çelik künt iğneyle ekleme tarafından kurtarıldı Vektör kurtarma en üst düzeye çıkarmak için açık kesir tam olarak alınması. Bu adım sırasında zamanlama çok önemlidir. Hazırlık saflığı ödün önlemek için koleksiyon (bulaşıcı) diğer aşamalarında geçişin toplanan önce durdurmak için esastır.
Elde edilen vektör titresi farklılıkları da paketlenmiş parçacıklar üretmek için iç yetenek vektör için bağlanabilir. Farklı AAV serotipleri arasında bir karşılaştırma bazı AAV vektörel çizimler (örneğin, AAV2) diğerlerinden daha yüksek bir titresi, üretmek daha zor olduğunu gösterdi41. Vektör, yağış sırasında desalting adım daha düşük bir titresi olası bir neden olabilir ve kolayca overconcentration33kaçınarak engelledi. Ayrıca, iodixanol gradyan tabanlı arıtma verimliliğini biraz serotipleri arasında değişir ve bu nedenle, farklı serotipi ile elde edilen titresi tutarsızlıkları41dikkat edilmesi mümkündür.
Son olarak, bu teknik bazı doğal değişkenlik qPCR DNA miktar için çok doğru bir yöntem olsa bile görülebilir işaret gerekir. Titrasyon doğruluk öncelikle kesin pipetting ve tüm çözümleri uygun vortexing bağlıdır. Okuma en doğru titresi garantilemek için qPCR bağımsız olarak tekrar edilebilir ve elde edilen değerlerin ortalaması. Bu protokol için sunulan astar seçimi bizim Laboratuvarda kullanılan pTransgene plazmid bulunan CBA organizatörü sırasını temel alır. CBA organizatörü birden çok hücre tipleri arasında yaygın sürücü ifade vektör alanında kullanılan güçlü bir sentetik organizatörü var. Sitomegalovirüs (CMV) erken artırıcı öğesi dahil olmak üzere birden çok öğe içermektedir; Düzenleyici, ilk exon ve ilk intron CBA gen; ve tavşan β globin gen splice alıcısı. Ancak, astar (organizatörü, transgene ve düzenleyici elemanlarının dahil) ifade kaset içinde bulunan hemen her öğe için tasarlanabilir. Titresi toplu işlemleri arasında karşılaştırılması da astar bölgeleri vektörel çizimler söz konusu ortak karşı kullanılan sağlamak mümkündür.
Sonuç olarak, bu protokolü AAV vektörleri ile capsids, genom yapılandırmaları, organizatörü türleri ve transgene yükler çeşitli üretmek için kullanılabilir. Bu kullanıcılar en iyi deneysel gereksinimlerinize uyacak şekilde kendi vektörel çizimler son özelliklerini kolayca uyum sağlar. Temsilcisi sonuçları sunulan örnekte PHP kullanımı. Verimli bir şekilde BBB haçlar, B kapsid yüksek verimli gen ekspresyonu MSS, aşağıdaki kuyruk ven enjeksiyon32verdi. CNS penetrant vektörel çizimler sistemik yönetim olası yan etkileri2,17,32açısından önemli avantajlar vardır. Periferik enjeksiyon invaziv tekniklerin uyarılar kaçınırken, olası bir alternatif AAV vektör teslimini beyin omurilik sıvısı içine oluşur intratekal teslimat olur. Bu teslim yolu transgene yaygın ifade MSS, periferik organ veya bağışıklık yanıtı42seviyesinin düşük daha az hedef kapalı etkilerini gösteren etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bunlar kuyruk ven enjeksiyon daha yüksek teknik beceri gerektirir gibi çok daha zor, ancak, intratekal enjeksiyonları vardır.
Bu teknolojiyi geliştirmek için daha fazla kapsid geliştirme gen terapisi uygulamalarda AAV vektör kullanmak için fırsatlar tarafından tahrik olacak. Bu tür yaklaşımlar amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı, Parkinson ve Alzheimer hastalığı18gibi şu anda tedavi edilemez CNS hastalıkları tedavi etmek için çekici olanaklar sunmaktadır.
The authors have nothing to disclose.
Mr Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (iki) doktora sonrası Bursu (133722/1204517N) tarafından desteklenen ve Fundación kardiyovasküler de Kolombiya ve Yönetim Bilimi Bölümü sürekli destek kabul eder, Teknoloji ve yenilik (Grant CT-FP44842-307-2016, proje kodu 656671250485). Mm bir iki Doktora Bursu (1S48018N) tarafından desteklenmektedir. M.G.H. bir VIB kurumsal grant ve Thierry Latran Vakfı (SOD-VIP), vakıf Alzheimer araştırma (SAO-FRA) (P #14006), iki (Grant 1513616N) ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) (Grant başlangıç için dış destek tarafından desteklenmiştir 281961 – AstroFunc; ««Kavramı Grant 713755 – reklam-VIP kanıtı). Yazarlar için fare yetiştirme onun yardımıyla Jeason Haughton, Stephanie Castaldo kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirme ona yardım için ve Caroline transfected HEK293T hücrelerin görüntülerini sağlamak için Eykens kabul edersiniz. M.G.H. Michael Dunlop, Peter Hickman ve Dean Harrison kabul eder.
Plasmid production | ||||
pTransgene plasmid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pCapsid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pHelper | Agilent | 240071 | ||
Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | ||
QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | ||
Cell culture and transfection | ||||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Life technologies | 11960-044 | Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter | |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10500-064 | ||
GlutaMAX supplement | GIBCO | 35050038 | ||
(200 mM) | ||||
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS430769 | ||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium | GIBCO | 14190094 | ||
HEK293T cells | American Tissue Culture Collection | CRL3216 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots | |
Cell culture dishes | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm diameter culture dishes | |
Cell scrapers | VWR | 10062-904 | ||
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times. | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution | |
Mutexi long-sleeve aprons | Fisher Scientific | 11735423 | Wear an apron over the top of a regular lab coat | |
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes | Fisher Scientific | 15401952 | ||
AAV Purification and desalting | ||||
Optiprep density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | CAUTION. Use under a laminar flow hood | |
Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z627992 | Sterilize before use | |
OptiSeal Polypropylene tubes | Beckman | 361625 | ||
Benzonase (250 U/µL) | Sigma-Aldrich | E1014 | Supplied as a ready-to-use solution | |
Acrodisc syringe filter | Pall corporation | 4614 | ||
Omnifix syringe (5mL) | Braun | 4617053V | ||
Blunt syringe needle | Sigma Aldrich | Z261378 | Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle | |
Aqua Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water' | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Millipore | UFC910024 | These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps | |
Pluronic F68 (100X) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v) | |
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Use skirted tubes for easy handling | |
AAV Titration | ||||
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) | Promega | R6421 | ||
DNAse I (1 U/µL) | Fisher scientific | EN0521 | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C | |
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) | Fisher scientific | AB2000 | ||
Eppendorf microtube 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | ||
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | ||
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells | Roche | 4729692001 | White polypropylene plate (with unique identifying barcode) | |
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film | Bio-Rad | msa5001 | ||
AAV Purity control | ||||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | ||
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | ||
Precision Plus prestained marker | Bio-Rad | 1610374edu | ||
1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Immunohistochemistry | ||||
Rabbit anti-GFP | Synaptic System | 132002 | 1:300 dilution | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1000 dilution | |
Equipment | Company | Catalog number | Comments | |
Vector production lab | ||||
Rotina 380 bench-top centrifuge * | Hettich | 1701 | ||
Optima XPN 80 ultracentrifuge * | Beckmann Coulter | A95765 | ||
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * | Beckmann Coulter | 337901 | ||
Entris digital scale * | Sartorius | 2202-1S | ||
Warm water bath * | Set at 37°C | |||
Ice bucket * | VWR | 10146-290 | Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas | |
Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | ||
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Co2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity | |
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use | |
Conventional lab | ||||
T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | ||
LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | ||
ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | ||
Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | ||
Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | For use with handmade or precast gels | |
ProteoSilver silver stain kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | High sensitivity protein detection with low background | |
Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml) | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 750257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 738257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 771257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Ice bucket with lid * | VWR | 10146-290 | ||
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * | VWR | 181-0065 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F144801 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123600 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123615 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123601 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123602 | ||
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes. |