هنا، نحن تصف استراتيجية فعالة واستنساخه لإنتاج وعيار ومراقبة الجودة دفعات من نواقل فيروسات الغدد المرتبطة. أنها تسمح للمستخدم بالحصول على إعداد ناقلات مع ارتفاع عيار (إيه وان × 1013 ناقلات جينومات مليلتر) ودرجة نقاء عالية، جاهزة للاستخدام في المختبر أو في الجسم الحي .
أدوات توصيل الجينات استناداً إلى فيروسات الغدد المرتبطة (AAVs) خيار شعبي لإيصال المتسلسلات للجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك تطبيقات العلاج الجيني. إف الناقلة عدم تكرار، قادرة على إصابة الفاصل وعدم تقسيم الخلايا وتوفير طويل الأجل التحوير التعبير. الأهم من ذلك، بعض اللقاح، مثل بي إتش بي وصف حديثا. ب، يمكن عبر الدم-الدماغ-الجدار (بي بي بي) في نماذج حيوانية، عقب تسليم الجهازية. يمكن أن تنتج نواقل إف كفاءة في المختبر. ومع ذلك، قوية واستنساخه البروتوكولات مطالبون بالحصول على ناقلات إف مع مستويات النقاء كافية وعيار قيم عالية بما يكفي للتطبيقات في فيفو . ويصف هذا البروتوكول استراتيجية فعالة واستنساخه لإنتاج ناقلات إف، استناداً إلى استراتيجية تدرج تنقية إيوديكسانول. طريقة تنقية إيوديكسانول مناسبة للحصول على دفعات ناقلات إف عيار ارتفاع درجة نقاء عالية، عند مقارنتها بأساليب تنقية أخرى. وعلاوة على ذلك، أن البروتوكول عادة أسرع من الطرق الأخرى المذكورة حاليا. وباﻹضافة إلى ذلك، سلسلة بوليميراز كمية رد فعل (qPCR)-يتم وصف الاستراتيجية القائمة على أساس لتحديد عيار ناقلات الأمراض، فضلا عن فضية تلطيخ طريقة سريعة ودقيقة لتحديد نقاء دفعة ناقلات. وأخيراً، نتائج تمثيلية لإيصال الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي، بعد الإدارة النظامية من إف-بي. ب، وترد. يجب أن تكون هذه النتائج الممكنة في جميع مختبرات استخدام بروتوكولات الموضحة في هذه المقالة.
على مدى الأعوام الثلاثين الماضية، آفس البرية من نوع قد تم تصميمها لإنشاء ناقلات إف المؤتلف، التي أثبتت أن تكون أدوات مفيدة استثنائية لنقل الجينات في الجهاز العصبي المركزي1،2،،من34، نهج 5،6 والعلاج الجيني للأمراض (بما في ذلك العلاجات التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير وأيما)4،7. ملاءمتها للاستخدام في الجهاز العصبي المركزي إلى حد كبير مستمد من قدرتها لتصيب خلايا غير تقسيم، بعد انتهاء الانقسامية، وتوجد عادة في الجهاز العصبي المركزي8. ومع ذلك، ناقلات المستندة إلى إف أيضا لديها ميزة السماح بتعبير طويل الأجل لأي4،التحوير علاجية معينة9 مع التماس استجابة المناعية أكثر اعتدالا مقارنة بسائر النواقل الفيروسية7، 8،10،،من1112.
هي العناصر الرئيسية لأي ناقل إف الجينوم وفي قفيصه. يتم آفس البرية من نوع واحد-الذين تقطعت بهم السبل (ss) فيروسات الحمض النووي مع جينوم حوالي 5 كيلوبس (kb)13. لإنتاج ناقلات إف المؤتلف، حذف من جينوم إف البرية من نوع الجينات مندوب و كاب (اللازمة للنسخ المتماثل للجينوم وجمعية قفيصه الفيروسية) وقدمت في ترانس، مما يترك مجالاً يحتوي على14،التحوير15كاسيت التعبير. تسلسل تكرار مقلوب المحطة الطرفية (الإسناد) الجينوم الفيروسي الأصلي هي فقط العناصر المحتجزة في متجه إف، كهذه ضرورية للنسخ المتماثل والتغليف3،،من1014. ويمكن إجراء هندسة عكسية ناقلات إف لتعزيز التعبير التحوير؛ طفرة في واحد من الإسناد يؤدي إلى تشكيل حلقة دبوس الذي يتيح فعالية توليد مكملة الحمض النووي حبلا3،،من715. والميزة الرئيسية لهذا التكوين، تسمى جينوم ذاتي تكميلية (sc)، أنها تتجاوز الحاجة إلى توليف حبلا الثانية النموذجية في دورة الحياة التقليدية من آفس، إلى حد كبير زيادة السرعة ومستويات التعبير التحوير 1. ومع ذلك، استخدام جينوم سكاف يقلل من قدرة البضائع المتجهة إلى 2.4 كيلو بايت تقريبا. وهذا يشمل تسلسل التحوير، فضلا عن أي تسلسل تنظيمي مثل المروجين أو مواقع microRNA الملزمة، للحد من التعبير إلى خلية معينة أنواع16.
يحدد التفاعل خلية ناقل المضيف قفيصه إف ويمنح درجة من انتحاء الخلية نوع أو الأنسجة للنمط المصلي المسيطر إف، التي يمكن أيضا استغلالها للحد من التعبير التحوير إلى مواقع محددة. تم العثور على عدة إف اللقاح في الطبيعة، بينما تم إنتاج أخرى في المختبرات من خلال النهج المؤتلف (أي، بي. ب). وباﻹضافة إلى ذلك، تضفي بعض كابسيدس أيضا الخصائص المفيدة الأخرى، مثل القدرة على عبور BBB، أسفر عن تسليم المتسلسلات في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي بعد الإدارة النظامية. وقد تبين هذا AAV9، وكذلك لوصف مؤخرا بي إتش بي. قفيصه ب17. نتيجة لذلك، يتم إثبات هذه اللقاح مهمة بصفة خاصة على نهج العلاج بالجينات الجديدة للأعصاب اضطرابات1،،من1718.
والهدف من هذا البروتوكول وصف طريقة فعالة من حيث التكلفة لإنتاج الصغيرة نواقل إف مع عيار عالية ونقائه. على الرغم من أن النتائج المعروضة هنا استخدام بي إتش بي. قفيصه ب وكاسيت تعبير سكاف، ومناسبة لإنتاج عدة إف ناقلات اللقاح وتكوينات الجينوم، مما يتيح أقصى قدر من المرونة التجريبية. ومع ذلك، يمكن أن تختلف الغلة المتجهات والنقاء النهائي اعتماداً النمط المصلي المسيطر الذي تم اختياره.
البروتوكول نفسه هو البديل للأسلوب الكلاسيكي ثلاثي-تعداء لإنتاج النواقل الفيروسية ويتضمن استخدام التدرج إيوديكسانول لناقلات تنظيف، التي كانت بالمقارنة مع استخدام التدرجات (CsCl) كلوريد السيزيوم، الكلاسيكية وذكرت لإنتاج ناقلات إف درجة نقاء أعلى في20،،من1921طريقة أكثر كفاءة من حيث وقت.
وتهدف الخطوات تعداء وتنقيتها وتركيز تتم وفقا للممارسات المختبرية الجيدة (GLP) في مختبر زراعة الأنسجة لتصنيفها لعمل النواقل الفيروسية. كل مهمة تحتاج إلى أن يؤديها وفقا للتشريعات المحلية والوطنية ذات الصلة فيما يتعلق بإنتاج النواقل الفيروسية واستخدامها. يجب أن يتم العمل تحت غطاء الاندفاق الصفحي وفي ظروف معقمة. داخل مرفق ناقلات الأمراض، ينصح بارتداء مئزر مختبر، بالإضافة إلى معطف مختبر زراعة الأنسجة العادية. وعلاوة على ذلك، يجب أن تلبس زوج مزدوجة من القفازات، فضلا عن أوفيرشوس البلاستيكية، في جميع الأوقات.
قبل بدء إنتاج ناقلات الأمراض وضمان جميع المعدات اللازمة وتتوفر والبلازميدات. 1) بكابسيد بلازميد يحتوي على مندوب الجين الذي يشفر أربعة من البروتينات غير الهيكلية اللازمة للنسخ المتماثل، إلا وهي Rep78، Rep68، Rep52، و Rep40، و كاب الجين الذي يشفر ثلاثة بروتينات قفيصه الهيكلية، هما VP1 و VP2 و VP3. 2) فيلبير بلازميد يحتوي على جينات الفئة هاء-2 وهاء-4و خامسا من إتش، مما يسهل إنتاج إف في الخلايا HEK293T. 3) بترانسجيني بلازميد يحتوي على كاسيت التعبير التحوير، يحف به الإسناد اثنين. يمكن أن تكون هذه البلازميدات تجميعي حيثياته في المختبر باستخدام تسلسل متاح على الإنترنت22. والبلازميدات أدلى حيثياته، وبخاصة تلك التي تحتوي على رواية المتسلسلات، تسلسل بالنسبة المطلوبة، للتأكد من أن التحوير والإسناد الصحيحة. وبدلاً من ذلك، يمكن اكتساب والبلازميدات premade مباشرة عن طريق مستودعات بلازميد على الإنترنت. عند الضرورة، يمكن تفصيل والبلازميدات وتنقيته باستخدام مجموعات قياسية، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة23.
عيار المتجهات والنقاء يمكن أن تؤثر سلبا على قدرة توصيل ناقل. يتم توفير بروتوكولات إضافية لتقييم جودة ناقل المنتجة. ناقلات النهائية ستكون مفيدة لإجراء دراسات للدالة cell CNS في تطبيقات في المختبر و في فيفو .
إنتاج المؤتلف إف المتجهات الموصوفة هنا استخدامات المواد والمعدات المشتركة بين معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية ومرافق الثقافة الخلية. أنها تسمح للمستخدم بالحصول على ناقلات إف الصف الخالص الإكلينيكية، والتي يمكن استخدامها لاستهداف أنواع متعددة من الخلايا والأنسجة عبر مجموعة من التطبيقات في المختبر و في فيفو . واحد من أعظم مزايا هذا البروتوكول، مقارنة بالآخرين (أي تنقية المستندة إلى CsCl)، هو أقصر وقت العمل اللازم. جاهزة للاستخدام إف الناقلة التي يمكن الحصول عليها في مدة أقصاها 6 أيام عمل بعد تعداء الأولية للخلايا HEK293T.
وهناك عدة عوامل يمكن أن تؤثر سلبا على العائد النهائي أو نوعية ناقل إف. تعداء ضعف الكفاءة واحد من الأسباب الرئيسية لمنخفضة غلة فيروسية33. توصية رئيسية هي استخدام خلايا HEK293T التي قد لا باساجيد أكثر من 20 مرة ولا تملك التقاء خلية أكبر من 90% في وقت تعداء21. وبالإضافة إلى ذلك، قد تعداء الأسلوب المحدد لها تأثير كبير على النتائج. ويستند هذا البروتوكول استخدام بي. بي هو بوليمر الموجبة مع القدرة على توصيل خارجية الحمض النووي لنواة الخلية من خلال توليد مركبات البوليمر والحمض النووي، المعروفة باسم بوليبليكسيس، التي يتم تناولها بالخلية والمتجر بهم عن طريق اندوسوميس34. تعداء المستندة إلى جزيرة الأمير إدوارد سهل وسريع لتنفيذ، وعلى النقيض من الأساليب الأخرى المستخدمة على نطاق واسع، مثل الترسيب المشارك من الحمض النووي مع فوسفات الكالسيوم35. أيضا، على أساس بي تعداء أرخص بكثير بالمقارنة مع أساليب أخرى أدخلت حديثا، مثل استخدام الدهون الموجبة والمغناطيس بوساطة تعداء36.
استراتيجية تنقية تلعب دوراً رئيسيا في البروتوكول. ومقارنة بالأساليب الأخرى، تنقية المستندة إلى إيوديكسانول تميل إلى تحتوي على نسبة أعلى من الجسيمات الفيروسية فارغة (20 في المائة)20. وهذا يقابل، إلى حد ما، حقيقة أن تنقية إيوديكسانول-على أساس نتائج بشكل روتيني في الاستعدادات ناقل إف مع نسبة الجسيمات للعدوى أقل من 100. وهذا يمثل تحسنا كبيرا بالمقارنة مع الإجراءات التقليدية المستندة إلى CsCl، الذي هو خسارة كبيرة للعدوى الجسيمات عنها37. أسلوب بديل مشترك آخر لتنقية ناقلات إف تنقية المستندة إلى الفصل اللوني. ومع ذلك، هذا الأسلوب قد العيب الرئيسي عمود معين مطلوب لكل ناقل قفيصه المستخدمة: فعلى سبيل المثال، حين معزولة تقليديا باستخدام أعمدة الهيبارين AAV2، هذه المنهجية لا يعمل مع AAV4 و AAV5، التي لا تملك الهيبارين الملزمة مواقع في هذه كابسيدس38. وبالنظر إلى أن تنقية اللوني أيضا باهظة الثمن، تنقية المستندة إلى إيوديكسانول عموما أكثر ملاءمة للمختبرات التي ترغب في إنتاج دفعات عالية الجودة من ناقلات إف على نطاق صغير33،39، 40-ومع ذلك، لتعظيم العائد النهائي ونقاء ناقل، الحذر الشديد مطلوب عند صنع التدرجات إيوديكسانول. إيوديكسانول الكسور المختلفة ينبغي أن تنقل إلى أنبوب تنبيذ فائق باستخدام ماصة باستور عقيمة نصيحة الذي لمس جدار الأنبوبة: يجب طرد إيوديكسانول من الماصة ببطء وباستمرار. كما تتراكم الجزيئات متجه في طبقة إيوديكسانول 40 ٪، يحتاج الرعاية الواجب اتخاذها لضمان أن الواجهات التدرج لا تخلط20. وأخيراً، ينبغي أن يمكن استردادها الكسر التي تحتوي على الناقل بإدخال إبرة حادة الفولاذ المقاوم للصدأ مع مقياس ليس أكبر من 20 غ. لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش متجه، ينبغي استرداد الكسر واضحة في مجملها. أثناء هذه الخطوة، التوقيت أمر بالغ الأهمية. لتجنب المساس بنقاء الإعداد، من الضروري أن تتوقف عن جمع قبل أن يتم جمع المراحل الأخرى (تلويث) التدرج.
الاختلافات في عيار المتجهات التي تم الحصول عليها يمكن أن يعزى أيضا إلى القدرة الجوهرية ناقل لإنتاج جزيئات تعبئتها. مقارنة بين مختلف إف اللقاح وأظهرت أن بعض ناقلات إف أكثر صعوبة لإنتاج في عيار أعلى من غيرها (مثلاً، AAV2)41. يمكن أن يكون سبب المحتمل عيار أقل هطول الأمطار خلال الخطوة desalting، ناقل، ومنعت بسهولة عن طريق تجنب اكتظاظ33. وعلاوة على ذلك، من الممكن أيضا أن كفاءة تنقية إيوديكسانول على أساس التدرج يختلف قليلاً بين اللقاح، وعليه، يمكن ملاحظة اختلافات في عيار الحصول عليها مع الأنماط المختلفة41.
وأخيراً، فإنه يحتاج إلى تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن قبكر أسلوب دقيق جداً للتحديد الكمي الحمض النووي يمكن ملاحظة بعض التغير المتأصلة في هذه التقنية. الدقة في المعايرة يعتمد أساسا على بيبيتينج دقيقة وفورتيكسينج السليم لكافة الحلول. يمكن ضمان عيار الأكثر دقة القراءة، تتكرر في قبكر بشكل مستقل، وحساب متوسط القيم التي تم الحصول عليها. اختيار الإشعال المعروضة في هذا البروتوكول يستند إلى تسلسل المروج CBA يقع في بلازميد بترانسجيني المستخدمة في المختبر. هو مروج CBA مروج اصطناعية قوية يستخدم على نطاق واسع في مجال مكافحة ناقلات للتعبير بالسيارة عبر العديد من أنواع الخلايا. وهو يتضمن العديد من العناصر، بما في ذلك عنصر محسن المبكر الفيروس المضخم للخلايا (CMV)؛ المروج وأول إكسون إنترون الأولى من الجينات CBA؛ ويقبلون لصق الجينات بيتا جلوبين الأرانب. ومع ذلك، يمكن تصميم كبسولة تفجير لتقريبا أي عنصر يقع ضمن كاسيت التعبير (بما في ذلك في المروج والتحوير والعناصر التنظيمية). مقارنة عيار عبر دفعات من الممكن أيضا، توفير الإشعال المستخدمة ضد المناطق المشتركة للناقلات في السؤال.
وفي الختام، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنتاج ناقلات إف مع مجموعة متنوعة من كابسيدس وتكوينات الجينوم وأنواع المروج والشحنات التحوير. هذا سوف تسمح للمستخدمين بسهولة التكيف مع خصائص النهائي لإيصالها إلى أفضل ما يناسب احتياجات التجريبية. في المقدمة في نتائج تمثيلية، مثال استخدام بي إتش بي. قفيصه ب، التي تعبر BBB كفاءة، أعطى التعبير الجيني ذات كفاءة عالية في الجهاز العصبي المركزي، حقن الوريد ذيل التالية32. الإدارة المنهجية لناقلات الاختراق الجهاز العصبي المركزي له مزايا كبيرة من حيث الآثار الجانبية المحتملة2،،من1732. بديل ممكن لحقن الطرفية، مع تجنب المحاذير التقنيات الغازية، هو التسليم إينتراثيكال، الذي يتكون من تسليم ناقل إف في السائل الدماغي النخاعي. وقد ثبت هذا الطريق التسليم لتكون فعالة، يظهر التعبير على نطاق واسع للتحوير عبر الجهاز العصبي المركزي، أقل آثار خارج الهدف في الأجهزة الطرفية، وانخفاض مستويات الاستجابة المناعية42. ومع ذلك، يتم حقن intrathecal تحديا أكبر بكثير، كما أنها تتطلب مهارات تقنية أعلى من حقن الوريد الذيل.
مزيد من التطوير قفيصه لصقل هذه التكنولوجيا سوف يكون مدفوعا بالفرص المتاحة لاستخدام ناقل إف في تطبيقات العلاج بالجينات. مثل هذا النهج يتيح إمكانيات جذابة لعلاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي حاليا المستعصية، مثل التصلب العضلي الجانبي-شاركو ماري الأسنان المرض والرعاش ومرض الزهايمر18.
The authors have nothing to disclose.
محمد معتمد من قبل فوندز voor ويتينشابيليجك أونديرزوك Vlaanderen (فو) زمالات ما بعد الدكتوراه (133722/1204517N)، وتعترف بالدعم المستمر من مؤسسة القلب والأوعية الدموية في كولومبيا وقسم العلوم الإدارية، التكنولوجيا والابتكار (منحة CT-FP44842-307-2016، رمز المشروع 656671250485). م. م. معتمد من قبل زمالة دكتوراه فو (1S48018N). وأيده M.G.H. منحة الحاصلة المؤسسية والدعم الخارجي من تييري لاتران مؤسسة (الهيئة العامة للسدود-VIP)، ومؤسسة لأبحاث مرض الزهايمر (ساو-FRA) (P #14006)، فو (منحة 1513616N)، ومجلس البحوث الأوروبي (المنسق) (ابتداء من المنح 281961-أستروفونك؛ والدليل على مفهوم المنح 713755–الإعلان–كبار الشخصيات). المؤلفون تعترف Haughton جاسون لمساعدته مع تربية الماوس، كاستالدو ستيفاني لمساعدة لها القيام بحقن الوريد الذيل، وكارولين ايكينس لتوفير صور transfected HEK293T الخلايا. وتسلم M.G.H. مايكل دنلوب، وبيتر هيكمان، وعميد هاريسون.
Plasmid production | ||||
pTransgene plasmid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pCapsid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pHelper | Agilent | 240071 | ||
Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | ||
QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | ||
Cell culture and transfection | ||||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Life technologies | 11960-044 | Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter | |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10500-064 | ||
GlutaMAX supplement | GIBCO | 35050038 | ||
(200 mM) | ||||
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS430769 | ||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium | GIBCO | 14190094 | ||
HEK293T cells | American Tissue Culture Collection | CRL3216 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots | |
Cell culture dishes | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm diameter culture dishes | |
Cell scrapers | VWR | 10062-904 | ||
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times. | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution | |
Mutexi long-sleeve aprons | Fisher Scientific | 11735423 | Wear an apron over the top of a regular lab coat | |
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes | Fisher Scientific | 15401952 | ||
AAV Purification and desalting | ||||
Optiprep density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | CAUTION. Use under a laminar flow hood | |
Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z627992 | Sterilize before use | |
OptiSeal Polypropylene tubes | Beckman | 361625 | ||
Benzonase (250 U/µL) | Sigma-Aldrich | E1014 | Supplied as a ready-to-use solution | |
Acrodisc syringe filter | Pall corporation | 4614 | ||
Omnifix syringe (5mL) | Braun | 4617053V | ||
Blunt syringe needle | Sigma Aldrich | Z261378 | Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle | |
Aqua Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water' | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Millipore | UFC910024 | These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps | |
Pluronic F68 (100X) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v) | |
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Use skirted tubes for easy handling | |
AAV Titration | ||||
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) | Promega | R6421 | ||
DNAse I (1 U/µL) | Fisher scientific | EN0521 | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C | |
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) | Fisher scientific | AB2000 | ||
Eppendorf microtube 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | ||
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | ||
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells | Roche | 4729692001 | White polypropylene plate (with unique identifying barcode) | |
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film | Bio-Rad | msa5001 | ||
AAV Purity control | ||||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | ||
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | ||
Precision Plus prestained marker | Bio-Rad | 1610374edu | ||
1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Immunohistochemistry | ||||
Rabbit anti-GFP | Synaptic System | 132002 | 1:300 dilution | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1000 dilution | |
Equipment | Company | Catalog number | Comments | |
Vector production lab | ||||
Rotina 380 bench-top centrifuge * | Hettich | 1701 | ||
Optima XPN 80 ultracentrifuge * | Beckmann Coulter | A95765 | ||
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * | Beckmann Coulter | 337901 | ||
Entris digital scale * | Sartorius | 2202-1S | ||
Warm water bath * | Set at 37°C | |||
Ice bucket * | VWR | 10146-290 | Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas | |
Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | ||
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Co2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity | |
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use | |
Conventional lab | ||||
T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | ||
LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | ||
ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | ||
Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | ||
Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | For use with handmade or precast gels | |
ProteoSilver silver stain kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | High sensitivity protein detection with low background | |
Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml) | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 750257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 738257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 771257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Ice bucket with lid * | VWR | 10146-290 | ||
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * | VWR | 181-0065 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F144801 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123600 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123615 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123601 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123602 | ||
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes. |