Summary

Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Published: September 07, 2019
doi:

Summary

Aquí se presenta un protocolo que combina un sistema de cocultivo endotelial neuronal in vitro e incorporación metabólica de sialoglicano con grupos funcionales bioortogonales para expandir las células primarias del tallo neural y del progenitor y etiquetar su superficie sialoglycoproteínas para el análisis de imágenes o espectrometría de masas de marcadores de superficie celular.

Abstract

Las células neurales del tallo y del progenitor (SSPC) son la base celular de las complejas estructuras y funciones del cerebro. Se encuentran en nichos especializados in vivo y pueden ser aislados y ampliados in vitro,sirviendo como un recurso importante para el trasplante de células para reparar el daño cerebral. Sin embargo, los SSPCE son heterogéneos y no están claramente definidos a nivel molecular o purificados debido a la falta de marcadores específicos de la superficie celular. El protocolo presentado, que se ha informado previamente, combina un sistema de cocultivo endotelial endotelial con un método de etiquetado de glicano metabólico para identificar el sialoglycoproteome superficial de los SSPCE primarios. El sistema de cocultura Endotelial NSPC permite la auto-renovación y expansión de los SCP primarios in vitro,generando un número suficiente de SSPCs. grupos funcionales bioortogonales. Al comparar el sialoglycoproteome de los SSPN autorenovadores expandidos en un cocultivo endotelial con el cultivo neural diferenciador, identificamos una lista de proteínas de membrana que se enriquecen en los SSP. En detalle, el protocolo implica: 1) la configuración de una cocultura endotelial NSPC y una cultura diferenciadora de la NSPC; 2) etiquetado con azidosugar per-O-acetilado N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); y 3) conjugación de biotina a sialoglycan modificado para la toma de imágenes después de la fijación del cultivo neural o extracción de proteínas del cultivo neural para el análisis de espectrometría de masas. A continuación, los candidatos de marcadores de superficie enriquecidos con NSPC se seleccionan mediante el análisis comparativo de datos de espectrometría de masas tanto de la NSPC expandida como de los cultivos neuronales diferenciados. Este protocolo es altamente sensible para identificar proteínas de membrana de baja abundancia en los materiales de partida, y se puede aplicar al descubrimiento de marcadores en otros sistemas con modificaciones apropiadas

Introduction

Las células madre neuronales se definen como una población celular multipotente que puede renovarse para mantener una piscina de células madre y diferenciarse en neuronas y glia. Son los principales tipos de células en el sistema nervioso y pueden ofrecer un gran potencial terapéutico en medicina regenerativa a través del trasplante celular en cerebros enfermos y lesionados1,2. A medida que avanza el desarrollo, la población de células madre neurales se vuelve heterogénea3,4, y la proporción de células madre neurales en el cerebro disminuye gradualmente5. En términos generales, las células madre neurales embrionarias y otras células progenitoras neuronales, denominadas colectivamente células madre neurales y progenitoras (SNCCP), se encuentran en las zonas germinales, la zona ventricular y la zona subventricular en ratones6. En el cerebro embrionario, las células madre neurales generan neuronas directa o indirectamente a través de células progenitoras intermedias (ICD), y en algunas especies a través de los progenitores de la zona subventricular externa (ORGs)7,8. La firma molecular específica, la morfología, la ubicación en el nicho de células madre y el potencial de diferenciación determinan el papel de cada subtipo en la organogénesis cerebral y las aplicaciones clínicas9. Sin embargo, los marcadores de superficie de celda disponibles actualmente no pueden discriminar y purificar inequívocamente diferentes subtipos de SENS, lo que limita la comprensión y utilización de estos subtipos.

La identificación de los marcadores de superficie de los SSPCCP primarios está limitada por tres obstáculos principales. El primero es el número limitado de células de SSPCCP en el tejido, lo que dificulta la preparación de muestras de proteínas de superficie celular para el análisis de espectrometría de masas común. La segunda limitación es la dificultad para producir subtipos de células puras para generar datos de proteínas de membrana específicos del subtipo. Por último, el tercer desafío es la baja proporción de proteínas de superficie celular en proteínas de células enteras, lo que dificulta sus sensibilidades de detección mediante el análisis de espectrometría de masas.

Para superar estos problemas, desarrollamos un enfoque quimioproteómico para enriquecer e identificar selectivamente las proteínas de la superficie celular en los SSP. primarios etiquetando metabólicamente las sialoglycoproteínas10. Para generar un número suficiente de SSP. , aprovechamos un protocolo establecido para expandir y mantener los SSP. embrionarios primarios en estados indiferenciados in vitro, co-culturando SNCCP con líneas celulares endoteliales del cerebro de ratón utilizando un soporte permeable matriz inserto(p. ej., transwell) sistema11. Por el contrario, los NPSC cultivados solos sin células endoteliales generan progenie diferenciada11,12. Por lo tanto, las muestras de proteínas de estos dos sistemas de cultivo se pueden analizar comparativamente para identificar proteínas que se expresan diferencialmente en SNCCP y neuronas diferenciadas. Como la mayoría de las proteínas de la superficie celular son modificadas por ácido siálico13, precursor de ácido siálico no natural análogo N-azidoacetylmannosamine-tetraacilado (Ac4ManNAz) se utilizó para secuestrar la vía metabólica intrínseca de modo que endógena, recientemente los sialoglycans sintetizados están etiquetados con grupos de azido, generando un mango químico14. A través de reacciones bioortogonales mediadas por azido-alquino, que conjugan biotina a sialoginas, las proteínas de la superficie celular se pueden visualizar y enriquecer para la identificación proteómica a través de un fluoróforo acoplado a la estreptavidina o matriz14.

Aquí, realizamos la tinción del análisis de gel SDS-PAGE del sialoglycoproteome superficial de los SSPCCP expandidos en un cocultivo endotelial y diferenciando células en un sistema no co-cultivo. También purificamos selectivamente el sialoglycoproteome superficial en los dos sistemas de cultivo para la comparación proteómica. Nuestro protocolo, en comparación con los protocolos tradicionales de purificación de superficies celulares basados en centrifugación15, aumenta la eficacia de la extracción al reducir los procedimientos de extracción de proteínas superficiales a través de la conjugación y la afinidad de etiquetas específicas Purificación. Mientras tanto, aumenta la pureza de extracción de las proteínas de la superficie celular basándose en la premisa de que la sialilación ocurre principalmente en las proteínas de la superficie celular. Aunque los factores endoteliales no pueden bloquear completamente la diferenciación de los SSPLIC expandidos, el estudio comparativo entre un cocultivo y un cultivo diferenciado proporciona un método conveniente para identificar las proteínas superficiales enriquecidas con células madre sin necesidad de analizar proteínas de PNJ purificadas por FACS16. Creemos que este enfoque se puede aplicar a estudios de proteínas superficiales en otros sistemas con las modificaciones adecuadas.

Protocol

Todos los protocolos animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Tsinghua y realizados de acuerdo con las directrices de la IACUC. La instalación de animales de laboratorio en la Universidad de Tsinghua ha sido acreditada por la AAALAC (Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International). Para la puesta en escena de embriones, a mediados del día del tapón vaginal identificado se calculó com…

Representative Results

Todo el procedimiento para la expansión in vitro y el etiquetado metabólico de los SSPCC embrionarios primarios toma 6 días(Figura 1A). La calidad de la línea celular BEND3 y los SSCCP primarios recién aislados son clave para un experimento exitoso. Las células BEND3 son la fuente de factores solubles que estimulan la autorenovación y proliferación de los SSP. Debe asegurarse de que las células BEND3 estén libres de contaminación y se dividan activ…

Discussion

Los marcadores de superficie se utilizan comúnmente para etiquetar y purificar tipos de células específicas in vitro e in vivo17,18. El descubrimiento de marcadores superficiales contribuye en gran medida a la medicina regenerativa y las investigaciones de células madre proporcionando herramientas moleculares para enriquecer selectivamente una población de células madre a partir de tejidos normales o patológicos y platos de cultivo, ofreciendo una célula …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Las figuras 1B, 1C, 1E y 1F se reproducen de Bai et al . 10 con permiso de la Royal Society of Chemistry. Agradecemos a Yi Hao en el laboratorio de X.C. por la edición de figuras. Este trabajo es apoyado por la National Natural Science Foundation of China (No. 91753206 a Q. S. y X. C., No. 31371093 a Q. S., y No. 21425204 y 21672013 a X. C.).

Materials

BEND3 ATCC CRL-229
DMEM Gibco 11960044
L-glutamine Gibco 25030081 1%
Sodium pyruvate Sigma P5280 1%
N2 supplement Gibco 17502048 1 to 100
N-acetyl-L-cysteine Sigma A7250 1 mM
Papain Worthington LS003726 10 U/mL
B27 supplement Gibco 17504044 1 to 50
Poly-L-lysine Sigma P4707
basic Fibroblast growth factor Gibco PHG0261 10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 1%
Fetal bovine serum Gibco 10099141 10%
HBSS Gibco 14175095
Tripsin-EDTA, 0.25% Gibco 25200056
DPBS Gibco 14190094
Transwell Corning 3450
Paraformaldehyde Sigma 158127 4%
Sucrose Sangon A100335
DAPI Gibco 62248
RIPA buffer Thermo Scientific 89900
SDS-PAGE loading buffer 2X Solarbio P1018
6-well plate Corning 3335
Tris-Glycine protein gel invitrogen xp00100box
mouse monoclonal anti-Nestin Developmental Study Hybridoma Bank Rat-401 1 to 20
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III Sigma T8860 1 to 1000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 invitrogen A-21121 1 to 1000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b invitrogen A-21143 1 to 1000
Albumin Bovine V Amresco 0332
Triton X-100 Amresco 0694
BCA assay kit Thermo Scientific 23225
dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Brij97 Aladdin B129088
CuSO4 Sigma 209198
alkyne-biotin Click Chemistry Tools TA105
BTTAA Click Chemistry Tools 1236
Ac4ManNAz Click Chemistry Tools 1084 100 µM
9AzSia synthesized in lab
sodium ascorbate Sigma A4034
Methanol Sigma 34860
EDTA Sangon A100322
NaCl Sangon A100241
SDS Sangon A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin invitrogen S21374 1 to 1000
Triethanolamine Sigma V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  invitrogen 60210
ammonium bicarbonate Sigma 9830
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Scientific 20278
Isoflurane RWD Life Science Co. 970-00026-00
DNase I Sigma DN25 12 µg/mL
urea Sigma U5378

References

  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Play Video

Cite This Article
Bai, Q., Dong, L., Shen, Q. Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan. J. Vis. Exp. (151), e58945, doi:10.3791/58945 (2019).

View Video