通过Sialoglycan的代谢标记识别主要神经干细胞和祖细胞的细胞表面标记
Summary
这里介绍的是一个协议，结合了体外神经内皮共培养系统和代谢结合的异形理念功能组，以扩大主神经干和祖细胞，并标记其表面用于细胞表面标记的成像或质谱分析的紫锥蛋白。
Abstract
神经干细胞和祖细胞（NSPCs）是大脑复杂结构和功能的细胞基础。它们位于体内的专门利基，可以在体外分离和扩展，作为细胞移植修复脑损伤的重要资源。然而，NSPCs是异构的，在分子水平上没有明确定义或由于缺乏特定的细胞表面标记而纯化。先前报道的该协议将神经内皮共培养系统与代谢甘油标记方法相结合，以识别初级NSPCs的表面脂质蛋白酶。NSPC-内皮共培养系统允许在体外自我更新和扩展初级NSPCs，产生足够数量的NSPCs。 培养的NSPC中的Sialoglycan使用非天然的亚西酸代谢报告器进行标记生物正交功能组。通过比较自更新的NSPC中的异二蛋白酶，在内皮共培养中扩展，具有不同的神经培养，我们确定了在NSPCs中丰富的膜蛋白列表。协议详细涉及：1）NSPC内生共文化与NSPC区分文化;2） 标记与阿齐多糖每O-乙酰化N-乙酰氨基苯甲胺（Ac4曼纳兹）;3）生物锡结合到改性双发胶，用于在神经培养固定后进行成像，或从神经培养中提取蛋白质进行质谱分析。然后，通过对扩展NSPC和分化神经培养的质谱数据的比较分析，选取了NSPC富集表面标记候选物。该协议对识别起始材料中低丰度膜蛋白具有高度敏感性，可应用于其他系统具有适当修改的标记发现
Introduction
神经干细胞被定义为一个多能细胞群，可以自我更新，以维持干细胞库，分化成神经元和胶质。它们是神经系统中的主要细胞类型，通过细胞移植到病变和受伤的大脑1，2，在再生医学中可能提供巨大的治疗潜力。随着发育的进行，神经干细胞群成为异质的3、4，神经干细胞在大脑中的比例逐渐下降5。一般来说，胚胎神经干细胞和其他神经祖细胞，统称为神经干细胞和祖细胞（NSPCs），位于小鼠6的生殖区、心室区和下室区。在胚胎大脑中，神经干细胞通过中间祖细胞（IPC）直接或间接地产生神经元，在某些物种中，通过外部潜区祖体（oRGs）7、8产生神经元。特定的分子特征、形态、干细胞利基的位置和分化潜力都决定了每个亚型在脑器官生成和临床应用中的作用9。然而，目前可用的细胞表面标记不能明确区分和纯化NSPCs的不同亚型，从而限制了对这些亚型的理解和利用。
主要NSPCs表面标记的识别受到三个主要障碍的限制。第一个是组织中NSPCs的细胞数量有限，因此很难制备细胞表面蛋白样本进行常见的质谱分析。第二个限制是难以生成纯细胞亚型，以生成亚型特异性膜蛋白数据。最后，第三个挑战是细胞表面蛋白在全细胞蛋白中的比例低，这妨碍了通过质谱分析的检测灵敏度。
为了克服这些问题，我们开发了一种化学蛋白质组的方法，通过代谢标记的西洛基蛋白质10来选择性地丰富和识别初级NSPC中的细胞表面蛋白。为了产生足够数量的NSPC，我们利用已建立的协议在体外扩大和维护未分化状态的初级胚胎NSPCs，使用可渗透支持与小鼠大脑内皮细胞系共同培养NSPC矩阵插入（例如，透井）系统11。相反，没有内皮细胞单独培养的核动力源产生分化的后代11，12。因此，可以相对分析来自这两个培养系统的蛋白质样本，以识别在NSPCs和分化神经元中不同表达的蛋白质。由于大多数细胞表面蛋白被硅酸13修饰，非天然的硅酸前体模拟N-azido乙酰氨基胺四合化（Ac4ManNAz）被用来劫持内在代谢途径，以便内源性，新的合成的硅石糖被标记为阿齐多组，产生化学手柄14。通过阿齐多-烷基介导的生物正交反应，将生物素与硅脂酶结合，细胞表面蛋白可以通过链球蛋白耦合荧光素或基质14进行可视化和富集，用于蛋白质组鉴定。
在这里，我们执行SDS-PAGE凝胶染色分析表面链胶蛋白酶从NSPC扩展在内皮共培养和区分细胞在非共培养系统中。我们还有选择地在两个培养系统中纯化表面的同步蛋白酶，以便进行蛋白组比较。与传统的离心基细胞表面纯化方案15相比，我们的方案通过特定的标记结合和亲和力减少表面蛋白提取程序，从而提高了提取效率净化。同时，在细胞表面蛋白主要发生细胞表面蛋白的前提下，提高了细胞表面蛋白的提取纯度。虽然内皮因子不能完全阻止扩大的NSPC的分化，但共同培养和分化培养之间的比较研究提供了一种方便的方法来精确定位干细胞富集的表面蛋白，而无需分析由FACS16纯化的NPC蛋白质。我们相信这种方法可以应用于研究其他系统的表面蛋白与适当的修改。
Protocol
Representative Results
Discussion
表面标记通常用于标记和纯化体外和体内的特定细胞类型17、18。表面标记物的发现为再生医学和干细胞研究做出了巨大贡献，它提供了分子工具，从正常或病理组织和培养皿中选择性地丰富干细胞群，提供纯化细胞用于临床或研究生物特性的资源。然而，由于难以将干细胞与原发性组织分离，神经干细胞研究的表面标记物开发进展缓慢。此处描述的协?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
图 1B、1C、1E 和 1F 从白等.10得到英国皇家化学学会的许可。我们感谢X.C.实验室的易浩进行人物编辑。这项工作得到中国国家自然科学基金（第91753206至Q.S.和X.C.，第31371093至Q.S.和21425204和21672013至X.C.）的支持。
Materials
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
| Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Transwell | Corning | 3450 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Sucrose | Sangon | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| SDS-PAGE loading buffer 2X | Solarbio | P1018 | |
| 6-well plate | Corning | 3335 | |
| Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
| mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
| mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1000 |
| Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Brij97 | Aladdin | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
| Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
| 9AzSia | synthesized in lab | ||
| sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| EDTA | Sangon | A100322 | |
| NaCl | Sangon | A100241 | |
| SDS | Sangon | A100227 | |
| Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1000 |
| Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
| ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
| urea | Sigma | U5378 |
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