이 프로토콜에는 요로 감염의 murine 모델에서 단일, 감염 방광 상피 세포를 분리 하는 간단한 방법을 설명 합니다.
이 문서에서는, 우리는 실험적으로 요로 감염 된 마우스에서 개별 세포내 세균성 지역 사회를 분리 하는 데 사용 하는 프로시저 개요. 프로토콜은 광범위 하 게 3 개의 섹션으로 분할 될 수 있다: 감염, 방광 상피 세포를 채취, 그리고 개별 감염 된 상피 세포를 분리 하 입 micropipetting. 격리 된 상피 세포 실행 가능한 박테리아 세포를 포함 하 고 거의 무료 오염 extracellular 박테리아, 다운스트림 단일 세포 분석에 이상적입니다. 감염의 시작에서 단일 세포내 세균성 지역 사회를 얻기에 걸린 시간은 약 8 h입니다. 이 프로토콜 배포 저렴 하 고 널리 사용 가능한 재료를 사용 하 여 우리가 예상 하는 그것은 또한 다른 감염 모델 그 감염 된 세포는 드문 경우에 단일 감염된 세포 세포 혼합물에서 분리에 이용 될 수 있다. 그러나, 입 micropipetting에 잠재적인 위험으로 인해이 절차 매우 전염 성 요원에 대 한 권장 하지 않습니다.
요로 감염 (UTIs) 가장 흔한 세균 감염 중 하나입니다. 여성의 약된 40-50%는 그들의 일생1동안 적어도 하나의 요로 감염 (UTI)를 경험 하는으로 예상 된다. 요로 감염의 주요 에이전트 중 하나 uropathogenic 대장균 (UPEC), 단순한 UTIs2의 70% 이상 차지 하는. 또한, UTI 자들의 약 1/43적절 한 항생제 치료도 불구 하 고 같은 긴장에 의해 발생 하는 재발 감염을 할 것 이다. 요로 감염의 높은 발생률 의료 시스템, 미국4년 이상의 $2 십억을 비용에 상당한 부담을 나타냅니다. 또한, UTIs를 치료 하는 항생제의 사용 또한 이끌어 낸다 상승 항생제 저항 속도 중요 한 공중 위생 관심사5.
따라서, 큰 노력을 UPEC 하는 재발 성 감염6,,78발생 하는 기능 뿐 아니라 요로 감염 하는 메커니즘을 이해에 배치 하고있다. 특히, 감염 마우스 모델 요8에 기여 하는 박테리아 및 호스트 특성 검사 사용 되었습니다. 이 마우스 모델 인간 환자에서 분리 된 수정 되지 않은 임상 계통에 적용 되 고의 이점이 있습니다. 이 모델 또한 잠재적으로 druggable 세균 경로 유형 1 pilus9 와 철 수집 시스템10등 요로 감염의 설립에 대 한 중요 한 발견에 지도 했다.
요로 감염에서 초기 이벤트를 공부 하 고 이러한 성공에 비해, 재발 성 요로 감염을 기본 메커니즘의 지식은 여전히 부족 한11. 한 가설 UPEC 항생제 치료를 evades 방광 상피 세포 내에서 세포내 세균성 지역 사회 (IBCs)를 형성 하 여 방광에 재발 성 감염을 일으키는 것입니다. IBCs 감염의 murine 모델와 인간의 요로 감염 환자12,13에서 확인 되었습니다. 소아 요로 감염 환자 로부터 소변 샘플에 IBCs의 존재는 되풀이14,15의 더 높은 속도와 연결 되었습니다. 그러나, IBCs를 분리 하 고 공부 하는 그들 내의 박테리아; 그들의 진귀 때문에 기술적으로 도전적인 것을 입증 했다 그것은 그 감염된 murine 방광 일반적으로 10-100 IBCs16추정. 또한, 방광 상피 세포는 비교적 큰 (50-120 µ m)17, 형광 배포에 도전 하기가 셀 정렬 (FACS)는 70 µ m 또는 100 µ m의 직경을 가진 전형적인 FACS 노즐 설계 지원. 따라서, 방광 상피 세포로 세포 종종 FACS는 응용 막힘을 방지 하기 전에 여과 의해 제거 됩니다.
연구소는 최근 방광18의 긁힌 것된 상피 세포 같은 혼합물에서 희귀 감염 된 세포를 분리 하 일반 하 고 경제적인 방법 설명. IBCs를 효과적으로 격리 하려면 우리 전통 입 pipetting 사용. 입 micropipetting는 단일 세포 및 배아 다운스트림 분석19,20,,2122,23, micromanipulation에 대 한 오래 사용 하는 기술 24 , 25. 자주의 원인이 되었습니다 (밀리 리터)에 큰 액체 볼륨의 전통적인 입 pipetting 실험실 관련 사고, 그리고 기술은 많은 전통적인 발생 학 외부 연구 커뮤니티에 의해 기피 바르게가 고 단일 셀 응용 프로그램입니다. 우리의 프로토콜은 큰 버퍼를 제공 하 여 위험을 완화 하는이 기술은19,20, 단일 셀 버전에 의해 영감을 (> 2 mL) 연구원과 액체의 볼륨에 비해 샘플 사이의 공기의 양도 (< 1 Μ L)입니다. 이 방법은 또한 활용 미세 제어의 그 입 micropipetting 제공 하는 전송 솔루션 및 고립 된 세포의 고 순도의 낮은 최종 볼륨을 변환. 저렴 한 재료를 사용 하는 기술 (<$ 50), 따라서 모든 실험실에서 구현 하기 위해 실현 되어야 하 고.
이 시각 프로토콜 설명 우리의 IBC 격리 기술을, 다른 연구원은이 기술은 복제 하고자 하는 지원에 대 한 참조를 제공 합니다. 연구원에 대 한 액세스 해 형광 현미경 (또는 유사한 장치) micropipetting에 대 한 개방적이 고 접근 이미징 무대와 라이브 영상 중 개별 상피 세포와 형광 박테리아를 시각화 하는 데 사용할 수 필요 합니다. (현미경 사용의 세부 사항에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하지만 다른 동일 악기 모델도 사용할 수 있습니다). 이 프로토콜은 요로 감염의 murine 모델에서 IBCs에 집중할 것 이다, 하는 동안 비슷한 방법 감염의 다른 모델에서 셀 정지에서 감염 된 세포를 분리에 적용 해야 합니다.
우리가 설명 하는 프로토콜은 요로 감염의 murine 모델에서 단일 IBCs의 격리에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜 격리 IBCs CFU에 배양 하 여 확인할 수 있습니다 가능한 세포내 박테리아를 포함 합니다. Extracellular 박테리아에 의해 작은 오염 IBCs에서 세포내 박테리아에 대 한 허용 프로토콜 결과 두 박테리아의 특성을 추가 하 고 IBC (그림 4C)에서 세포를 호스트. 우리 또한 표시 단일 IBC에서 박테리아 정량그림 4(C)와 같은 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 제안 하는 다른 체 외 분석에 대 한 우리의 기술은 프로세스 IBCs에 사용할 수 있습니다. 몇 가지 5 IBCs로에서 수확 하는 박테리아를 풀링 하 여 추가 설명 3 세균 유전자에서 qRT-PCR 분석을 수행 하는 능력 좋은 품질 RNA (그림 4D) 우리의 절연된 IBCs에 박테리아에서 수확 수 있습니다 제안 합니다. 결합, 우리 하는 데이터는 단일 IBCs에 (예: RNA 시퀀싱) 게놈 넓은 RNA 분석을 수행 수 있습니다이 격리 기술을 사용 하 여 나타냅니다.
IBC 번호 UTI8927에 의해 감염 하는 검은 6 쥐의 방광에 피크 때가 있기 때문에이 프로토콜에서 우리 6 h 시간 포인트에 집중 했다. 또한, 우리는 또한 사용 정적 세균성 문화 시스템 UTI89에 타입 1 pilus 식의 수준을 향상 시키기 위해. 타입 1 pilus의 식을 연결할 감염 방광 상피 세포28을 대장균 에 대 한 중요 한입니다. 그러나,이 식은 단단히 규제29 이며 환경 단서30변경으로 알려져 있습니다. 일관 된 감염 형 및 IBCs의 충분 한 번호를 유지, 대장균 테스트 이전 작업 (약간 웅 외.8에서 수정) 2 x 24 h 정적 세균성 문화 및 6 h 감염 시간 포인트를 사용 하 여 것이 좋습니다. NU14, UTI89,2829등 긴장. 그러나, 그것은 이러한 변수는 다른 요로 긴장 또는 각 감염에서 IBCs의 이상적인 수를 얻기 위해 다른 쥐 긴장 조정 될 필요가 있을 것 이다.
웅 외.8 에서 프로토콜 여성 마우스만 사용 하 여, 하는 동안 다른 설립된 프로토콜 설정 남성 쥐에 요로 감염 보고31되었습니다. 이 모델에서는 또한 남성 생쥐에서 방광염 IBC 통로를 따 랐 다. 남성 및 여성 쥐의 방광은 크기에서 유사 하다, 우리는 뿐만 아니라 감염 된 남성 쥐에 우리의 IBC 격리 프로토콜을 사용할 수 있는 예상.
이 프로토콜에 활용 하는 비교적 간단한 기술도 대부분 실험실에서 배포할 수 있습니다 보장 합니다. 이 프로토콜에 관련 된 중요 한 단계 중 하나는 관심의 셀 형식을 선택 하기 위한 microcapillaries를 만드는 유리 모 세관의 당기는. 이 단계를 만든 microcapillaries의 직경에 유연성에 대 한 허용 하 고 따라서 메서드는 여러 다른 대상 셀 형식에 확장 될 수 있습니다. 그러나,이 모세 혈관을 만드는 고유한 변이 때문 배려는 최종 직경 가능한 범위에 있는지 확인을 한다. 모 세관 너무 좁은 경우에, 그들은 관심의 셀을 선택 하 실패 하지만 한 시도에서 여러 셀을 선택할 수 있는 그들은 너무 넓은 경우. 또한, 모 세관을 당기기의 과정에서 화기를 사용 하 여 microcapillaries를 만들려고 연구원 발생 등을 방지 하기 위해 처리 해야 하는 그래서 화상 및 화재, 내재 된 위험을 운반 합니다. 가변성으로 오픈 화재 위험을 줄이기 위해 이러한 모세 혈관을 만들기에 참여 연구원 만들 수 전통적인 micropipette electrophysiological 실험 (예를 들어, PC-100, Narishige 그룹)에 대 한 사용과 같은 기계를 당기의 사용. 으로이 기계는 모세 혈관을 중력 또는 로봇 플랫폼의 사용, 그들은 감염 모델의 요구에 맞게 맞춤화 할 수 있습니다. 그러나, micropipette 당기는 기계 사용할 수의 광범위는 개별 연구원이이 프로토콜 사용 하기 위해 적절 한 최종 모 세관의 직경을 결정 하기 위해 몇 가지 시행 착오를 통해 갈 필요가 있을 것 이다 의미 합니다.
제시 프로토콜 IBC를 시각적으로 식별 하는 형광 태그를 표현 하는 박테리아의 사용. 따라서,이 기술은 유전자 감염 유기 체를 수정 하는 연구팀은 능력에 의해 제한 됩니다. 특히 UPEC에 대 한 CFT073 및 NU14 같은 IBC 형성 긴장 성공적으로 변형 되어 GFP 표현 플라스 미드32,,3334;와 이 따라서 같은 프로토콜에 사용 해야 합니다. 에 대해 IBCs의 발생률에 대 한 추정치는 마우스 방광 (70 m m2)35, 개별 상피 세포 (50-120 µ m)17의 길이 그리고 단일 방광16IBCs의 주파수 영역에 따라, 1에서 1000 셀 (또는 0.1%)입니다. 이 견적에는 드문 이벤트를 대상으로 우리의 세포 격리 프로토콜의 유틸리티 진열 장. 우리의 프로토콜을 통해 셀 선택의 정밀도 및 당길 수 있다 모 세관 직경의 광범위가이 프로토콜 세포내 박테리아 감염의 vivo에서 그리고 생체 외에서 다른 모델에서을 사용할 수 있습니다 하는 것이 좋습니다. 사실, 우리 성공적으로 감염 된 교양된 방광 상피 세포 (데이터 표시 되지 않음)을이 기법을 이용 했다.
더 기술적으로 도전적인 단계 프로토콜에의 한 방광 상피 세포 근 근에 대 한 노출 반전 형 이다 이다. 우리는 그것도 방광 근 근에 대 한 그것을 밖으로 넓히다에 절 개를 만들 수 발견 했다. 그러나 때문에 주의 오픈; 절단의 과정에서 방광의 상피 세포에 피해를 줄이기 위해 해야 이상적으로 단일 컷 방광 오픈 퍼짐에 활용 되어야 합니다. 또한, 컷 여야 한다 차가운 PBS에 손실을 방지 하기 위해 실수로 셀 또는 방광 직물의 과정에서.
입이 프로토콜에서 IBCs의 pipetting 뿐만 아니라 셀 함께 전송 솔루션의 최종 볼륨을 제한으로 셀 선택 과정을 더 잘 제어할을 제공 합니다. 정밀한 제어 및 연구원은 입에서 솔루션의 큰 분리 또한 전송 볼륨 microliter 범위를 nanoliter 내에 있다 연구원의 안전을 극대화 합니다. 반면, 우리의 경험과 현대 micropipette 이다 그것은 더 많은 주변 액체와 ibc, extracellular luminal 박테리아와 오염에 잠재적으로 주요 셀 전송 하는 경향이 있다. 우리의 찾는 그 입 pipetting 제공 합니다 높은 성능을 다른 단일 셀 격리 방법 또한 다른 실험실22,,2324에 의해 보고 되었습니다. 단일 셀 격리, 외 입 pipetting도 사용 되었습니다 단일 셀 electroporation에 뉴런25, 추가 유틸리티 및 훈련된 연구원 기술 달성 수 분 제어를 보여줍니다. 그러나, 안전은 기본의 중요성, 그리고 잠재적인 추가 조치 사용 되 고 병원 균에 따라 취할 수 있는 것이 좋습니다: (i) 연구원과 생물 소재, 예를 들어 한 발음을 사용 하 여 사이 공기 버퍼의 확장 추가적인 방 벽 역할을 aspirating 피 펫에 솜 털 같은 물리적 필터를 추가 하는 큰 볼륨 (예: 5 mL), 또는 (ii) 피 펫.
위험 평가 입 pipetting는 여전히 너무 위험한 결론에 이르게 하는 경우에 상용 로봇 설정 (예: nanoinjections 사용) 위한 안전한 방법을 제공 하기 위해 우리의 기술의 다른 섹션으로 결합 될 수 있다 혼합된 인구에서 감염 된 세포를 분리. 그것은 로봇 micromanipulator를 사용 하 여 우리의 경험 IBC 격리에 비해 입 pipetting, 방광 상피 세포 크기에 큰 내부 실험 변화 하기가 어려운 사용자의 감소 속도 증명 하고있다 언급 되어야 단일 IBCs를 선택 하는 데 필요한 힘을 결정 하는 로봇 팔. 그럼에도 불구 하 고, 그 질병의 높게 전염성이 에이전트와 작업에 대 한 비록 costlier, 실행 가능한 옵션이 남아 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 국립 연구 재단, 총리의 사무실, 싱가포르, 그것의 NRF 연구 장학금 제도 의해 지원 되었다 (NRF 수상 no. NRF-RF2010-10); 싱가포르의 보건의 국립 의학 연구 위원회 (NMRC/CIRG/1358/2013); 그리고 싱가포르 게놈 연구소 (GIS) / 과학, 기술, 및 연구 기관 (A * STAR).
1.5ml eppendorf tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
100% ethanol | For Alcohol Burner | ||
15 ml conical tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
1ml Tuberculin Syringe | BD Biosciences | 302100 | |
3% Bacterial Agar | For static bacterial culture and OD measurement | ||
70% ethanol | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Aesculap anatomic forceps | Braun/Kruuse | BD222R | For initial dissection of mouse (skin, fascia) |
Alcohol Burner | Wheaton | 237070 | |
Aspirating pipette | BD Biosciences | 357558 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Bacterial loops | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424 | Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes |
Conical flasks | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Digital camera for microscope | Olympus | DP71 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Glass Capillaries | Kimax | 6148K07 | |
Iris Scissors STR SS 110MM | Braun | BC110R | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
Kanamycin Sulfate | Calbiochem | 420311 | For static bacterial culture and OD measurement |
LB broth (Miller) | Thermo/Gibco | 10855021 | For static bacterial culture and OD measurement |
Light source unit for microscope | Olympus | LG-PS2 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Lubricant | KY | Any similar commercial medical lubricant will suffice | |
Macro fluorescence microscope | Olympus | MVX10 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Micropipette + micropipette tips | For static bacterial culture and OD measurement | ||
PBS 1x | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Pipette controller + Pipettes | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Polyethylene Tubing | BD Intramedic | 427401 | |
Precision Glide needle 30G | BD Biosciences | 305107 | Possibly under new catalogue number (305106) |
Splinter forceps curved | Braun | BD312R | |
Spray bottle (for ethanol) | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Square cuvettes | Elkay | 127-1010-400 | For static bacterial culture and OD measurement |
Sterilgard III Advance Safety Cabinet | Baker | SG403 | Any biosafety cabinet with a UV irridiator |
Sterilin 90mm Standard Petri Dish | Thermo | 101VR20 | Any sterile petri dish |
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm | Braun | OK366R | Recommended for harvesting of bladder |
Surgical Scissors STR S/B 105MM | Braun | BC320R | |
Tabletop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals |
WPA C08000 cell density meter | Biowave (Biochrom) | 80-3000-45 | For static bacterial culture and OD measurement |