Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om één, besmet-blaas epitheliale cellen van een lymfkliertest model van urineweginfectie te isoleren.
In dit artikel schetsen wij een procedure gebruikt om te isoleren van de individuele intracellulaire bacteriële gemeenschappen van een muis die experimenteel heeft geweest septisch in de urinewegen. Het protocol kan grofweg worden verdeeld in drie secties: de infectie, oogsten van de epitheliale cellen van de blaas- en mond micropipetting isoleren van individuele geïnfecteerde epitheliale cellen. De geïsoleerde epitheliale cel bevat levensvatbare bacteriële cellen en is bijna vrij van verontreiniging van extracellulaire bacteriën, waardoor het ideaal is voor downstream eencellige analyse. De tijd genomen vanaf het begin van de infectie aan het verkrijgen van een enkele intracellulaire bacteriële Gemeenschap is ongeveer 8 h. Dit protocol is goedkoop om te implementeren en maakt gebruik van algemeen beschikbare materialen, en wij verwachten dat het ook kan worden gebruikt in andere modellen van de infectie te isoleren van enkele geïnfecteerde cellen uit cel-mengsels, zelfs als die geïnfecteerde cellen zeldzaam zijn. Echter, als gevolg van een potentieel risico in mond micropipetting, deze procedure wordt niet aanbevolen voor zeer besmettelijke agentia.
Infecties van de urinewegen (UTI) zijn een van de meest voorkomende bacteriële infecties. Naar schatting 40-50% van de vrouwen wordt verwacht dat de ervaring van ten minste één infectie urinewegen (UTI) tijdens hun levensduur1. Een van de belangrijkste verwekkers van UTI is de uropathogenic E. coli (UPEC), die goed is voor meer dan 70% van ongecompliceerde UTI2. Bovendien zullen ongeveer een kwart van degenen die een UTI hebben een terugkerende infectie, vaak veroorzaakt door dezelfde stam, ondanks adequate behandeling met antibiotica3hebben. De hoge incidentie van UTI vertegenwoordigt een aanzienlijke last voor de stelsels voor gezondheidszorg, kost meer dan 2 miljard dollar per jaar in de VS4. Bovendien, het gebruik van antibiotica voor de behandeling van UTI leidt ook tot stijgende prijzen van de antibioticaresistentie, die is een grote volksgezondheid bezorgdheid5.
Daarom heeft een grote inspanning gebracht in het begrip van de mechanismen waarmee UPEC infecteert de urinewegen, evenals haar vermogen tot terugkerende infecties6,7,8. In het bijzonder is een muismodel van infectie te onderzoeken van bacteriële en gastheer kenmerken die aan de UTI8 bijdragengebruikt. Deze muismodel heeft het voordeel van de toepassing op ongewijzigde klinische stammen geïsoleerd van menselijke patiënten. Dit model heeft ook geleid tot de ontdekking van een potentieel druggable bacteriële trajecten belangrijk voor inrichting van UTI, zoals de Type 1 pilus9 en ijzer acquisitie systemen10.
Vergeleken met deze successen bij het bestuderen van de vroege gebeurtenissen in UTI, ontbreekt kennis van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de terugkerende UTI nog11. Een hypothese is dat UPEC antibiotische therapie ontwijkt en terugkerende infecties in de blaas veroorzaakt door de vorming van intracellulaire bacteriële Gemeenschappen (IBC’s) binnen de epitheliale cellen van de blaas. IBC’s zijn geïdentificeerd, zowel in menselijke UTI patiënten-12,13in lymfkliertest modellen van infectie. De aanwezigheid van IBC’s in urine monsters van pediatrische patiënten van de UTI is geassocieerd met hogere tarieven van herhaling14,15. IBC’s isoleren en bestuderen van de bacteriën in hen heeft echter bewezen technisch uitdagend vanwege hun zeldzaamheid; geschat wordt dat een besmette lymfkliertest blaas doorgaans alleen 10-100 IBC’s16 heeft. Bovendien, de epitheliale cellen van de blaas zijn relatief groot (50-120 µm)17, maken het uitdagend om te implementeren fluorescentie bijgestaan cell sorting (FACS) gezien het feit dat typische FACS sproeiers zijn ontworpen met een diameter van 70 µm of 100 µm. Dus, worden de cellen zo groot als de epitheliale cellen van de blaas vaak verwijderd door filtratie vóór FACS om verstopping van de fluidics.
Onze lab beschreven onlangs een algemene en economische methode voor het isoleren van zeldzame geïnfecteerde cellen uit mengsels zoals geschraapt epitheliale cellen van de blaas18. Effectief isoleren IBC’s, gebruikten we de traditionele mond pipetteren. Micropipetting van de mond is een techniek die al lange tijd voor micromanipulation van afzonderlijke cellen en embryo’s voor downstream analyse19,20,21,22,23, gebruikt heeft 24 , 25. traditionele mond pipetteren van grote vloeibare volumes (in milliliter) is vaak de oorzaak geweest van laboratorium gerelateerde ongevallen en de techniek heeft terecht is gemeden door veel van de onderzoeksgemeenschap buiten traditionele embryologie en eencellige toepassingen. Ons protocol is geïnspireerd door de eencellige versies van deze techniek19,20, die risico meebrengt kleiner maken door middel van een grote buffer (> 2 mL) van lucht tussen de onderzoeker en het monster vergeleken met de hoeveelheid vloeistof overgedragen (< 1 ΜL). Deze methode maakt ook gebruik van de fijne controle dat mond micropipetting biedt, wat zich vertaalt naar een lage eindvolume van de omringende oplossing overgedragen en hoge zuiverheid van geïsoleerde cellen. De techniek maakt gebruik van goedkope materialen (< 50 dollar), en dus om uit te voeren in alle laboratoria haalbaar moet zijn.
Dit visuele protocol beschrijft onze IBC isolatie techniek, bieden een referentie om te helpen andere onderzoekers proberen te repliceren deze techniek. De onderzoeker moet toegang tot een fluorescente ontleden Microscoop (of soortgelijke apparatuur) die kan worden gebruikt voor het visualiseren van afzonderlijke epitheliale cellen en de fluorescerende bacteriën tijdens live weergave, met een open en toegankelijke imaging stadium voor micropipetting (Zie de Tabel van materialen voor de details van de Microscoop gebruikt, hoewel andere modellen gelijkwaardig instrument kunnen ook worden gebruikt). Terwijl dit protocol zich op IBC’s in een lymfkliertest model van UTI richten zal, ook soortgelijke methoden gelden voor het isoleren van geïnfecteerde cellen van cel schorsingen in andere modellen van infectie.
Het protocol dat wij hebben beschreven staat voor de isolatie van één IBC’s uit een lymfkliertest model van UTI. Dit protocol isoleert IBC’s met haalbare intracellulaire bacteriën, die kunnen worden geverifieerd door het kweken voor kve. De resultaten van de protocol bij intracellulaire bacteriën van IBC’s met weinig verontreiniging door extracellulaire bacteriën, waardoor verdere karakterisering van beide bacteriën en gastheer van de cel van een IBC (Figuur 4C). Laten we ook zien dat de bacteriën uit een enkele IBC kunnen worden gebruikt in downstream toepassingen zoals qPCR (Figuur 4C), wat suggereert dat onze techniek kan worden gebruikt om proces IBC’s voor andere in vitro analyses. Door het bundelen van de bacteriën geoogst uit zo weinig als 5 IBC’s, we verder laten zien ons vermogen om qRT-PCR-analyses uit te voeren op drie bacteriële genen, suggereren dat goede kwaliteit RNA kan worden geoogst van de bacteriën in onze geïsoleerde IBC’s (Figuur 4D). Gecombineerd, de gegevens die we hebben laten zien aangeven dat het uitvoeren van genoom-brede analyse van de RNA (zoals RNA sequencing) op één IBC’s mogelijk met behulp van deze isolatie-techniek kan zijn.
In dit protocol hebben we gericht op het punt 6 h tijd want dat is bij IBC nummers piek in het blazen van zwarte 6 muizen geïnfecteerd door UTI8927. Bovendien hebben we ook een statische bacteriecultuur systeem gebruikt ter verbetering van het niveau van type 1 pilus expressie in UTI89. De expressie van type 1 pilus is essentieel voor E. coli te hechten aan en blaas epitheliale cellen28te infecteren. Deze expressie is strak gereguleerde29 echter en milieu signalen zijn gekend om te veranderen het30. Teneinde een consistente infectie fenotype en een voldoende aantal IBC’s, raden we een 2 x 24 h statische bacteriecultuur (licht gewijzigd van Hung et al.8) en het tijdstip van 6 h infectie wanneer werken met eerder E. coli getest stammen zoals NU14 en UTI8928,29. Het is echter mogelijk dat deze variabelen worden aangepast in andere soorten van UTI of in andere soorten muizen moeten te verkrijgen van het ideale aantal IBC’s van elke infectie.
Het protocol van Hung et al.8 gebruikt alleen vrouwelijke muizen, zijn andere vastgestelde protocollen voor de vaststelling van urineweginfectie bij mannelijke muizen gerapporteerde31geweest. In dit model gevolgd blaasontsteking bij mannelijke muizen ook het IBC-traject. Zoals het blazen van mannelijke en vrouwelijke muizen vergelijkbaar in grootte zijn, verwachten wij dat onze IBC isolatie protocol kan worden gebruikt op besmette mannelijke muizen als goed.
De relatief eenvoudige technologie gebruikt in dit protocol zorgt er ook voor dat het kan worden ingezet in de meeste laboratoria. Een van de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij dit protocol is het trekken van glas haarvaten maken microcapillaries voor het selecteren van het celtype van belang. Deze stap zorgt voor flexibiliteit in de diameters van microcapillaries gemaakt, en dus de methode kan worden uitgebreid naar meerdere soorten van de cellen van de verschillende doelgroepen. Echter, als gevolg van de inherente variatie in het creëren van deze capillairen, moet worden gezorgd om ervoor te zorgen dat de definitieve diameter in een bruikbare bereik. Als de haarvaten te smal, verzuimen te halen van de cel van belang, maar als ze te breed zijn gemaakt, meerdere cellen kunnen worden geselecteerd in een enkele poging. Bovendien draagt het gebruik van een open vuur tijdens het proces van de capillaire trekken een inherent risico van brandwonden en brand, zodat de onderzoeker probeert te maken van de microcapillaries zorgen moet om te voorkomen dat dergelijke gebeurtenissen die zich voordoen. Om de variabiliteit evenals de open brandgevaarlijk zijn betrokken bij het maken van deze haarvaten, de onderzoeker kon maken gebruik van een traditionele micropipet trekken machine, zoals die worden gebruikt voor elektrofysiologische experimenten (bijvoorbeeld PC-100, Narishige groep). Aangezien deze machines maken gebruik van de zwaartekracht of robotic platforms te trekken van de haarvaten, zij kunnen worden aangepast aan de behoeften van het model van de infectie. De brede waaier van micropipet machines beschikbaar trekken betekent echter dat de individuele onderzoeker zal moeten gaan via bepaalde trial and error om te bepalen van de juiste definitieve capillaire diameter voor gebruik met dit protocol.
Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van bacteriën die uiting geven aan een fluorescerende tag om visueel identificeren de IBC. Dus, deze techniek wordt beperkt door de onderzoekers kunnen de besmettelijke organisme genetisch te wijzigen. Speciaal voor UPEC, zijn IBC-vormende stammen zoals CFT073 en NU14 met succes veranderd met GFP-uiten plasmiden32,33,34; Daarom moet deze geschikt voor gebruik in hetzelfde protocol. Gebaseerd op het gebied van de muis blaas (70 mm2)35, de lengte van de afzonderlijke epitheliale cellen (50-120 µm)17en de frequentie van de IBC’s in een enkele blaas16, een conservatieve schatting voor de incidentie van IBC’s is over 1 in 1000 cellen (of 0,1%). Deze raming toont het nut van onze cel isolatie protocol te richten op zeldzame gebeurtenissen. De precisie van de celselectie via onze protocol en het brede scala van capillaire diameters die kan worden getrokken suggereren dat dit protocol kan worden gebruikt om te isoleren van de intracellulaire bacteriën van andere modellen van het in vivo en in vitro van infectie. Inderdaad, hebben we met succes deze techniek gebruikt om te isoleren van de epitheliale cellen van de besmette gekweekte blaas (gegevens niet worden weergegeven).
Een van de meer technisch uitdagende stappen in het protocol is het omkeren van de blaas om de epitheliale cellen voor schrapen bloot te stellen. We hebben gemerkt dat het ook mogelijk te maken van een sneetje op de blaas aan splay het uit voor het schrapen. Maar die zorg moet worden genomen ter beperking van de schade aan de epitheliale cellen van de blaas tijdens het proces van snijden open; ideaal moet een enkele snede worden gebruikt om de blaas open splay. Bovendien moet de cut in koude PBS, ter voorkoming van verlies van cellen of blaas weefsel tijdens het proces worden gemaakt.
Mond pipetteren van de IBC’s in dit protocol biedt meer controle over het selectieproces van de cel, evenals het beperken van het uiteindelijke volume van de oplossing samen met de cel overgedragen. De fijne controle en de grote scheiding van de oplossing van de onderzoekers mond maximaliseert ook de veiligheid van de onderzoeker, zoals de volumes overgedragen zijn binnen de nanoliter microliter bereik. Onze ervaring met de moderne micropipet is daarentegen dat het de neiging om meer omliggende vloeistof en cellen met de IBC, potentieel leiden tot verontreiniging met extracellulaire luminal bacteriën overbrengen. Onze bevinding dat mond pipetteren een hogere prestaties over andere eencellige isolatie methoden biedt is ook gemeld door andere laboratoria22,23,24. Afgezien van enkele cel isolatie, is mond pipetteren zelfs gebruikt in eencellige electroporation voor neuronen25, die verder toont het nut en de minuut controle die een getrainde onderzoeker met de techniek bereiken kan. Veiligheid is van primair belang echter, en wij stellen eventuele aanvullende maatregelen die kunnen worden genomen, afhankelijk van de ziekteverwekkers wordt gebruikt voor: (i) de uitbreiding van de buffer van de lucht tussen de onderzoeker en het biologisch materiaal, bijvoorbeeld met behulp van een zuigen Pipetteer met een groter volume (bijvoorbeeld 5 mL), of (ii) het toevoegen van een fysieke filter zoals katoen, wol in de zuigen pipet om op te treden als een extra barrière.
In gevallen waar een risicobeoordeling tot de conclusie leidt dat mond pipetteren nog steeds te riskant is, kunnen verkrijgbare robotic opstellingen (zoals die worden gebruikt voor nanoinjections) worden gecombineerd met de andere gedeelten van onze techniek om een veiligere methode voor isoleren van geïnfecteerde cellen van gemengde bevolkingsgroepen. Opgemerkt moet worden dat onze ervaring met het gebruik van een robotachtige micromanipulator blijk heeft gegeven van een verminderde tarief van IBC isolement ten opzichte van mond pipetteren, zoals de grote intra experimentele variatie van de grootte van de epitheliale cellen van de blaas het uitdagend voor de gebruiker maakt van een robotachtig wapen om te bepalen van de kracht die nodig is te halen enkele IBC’s. Toch blijft het een haalbare, hoewel duurder, optie voor degenen die werken met zeer besmettelijke agentia van ziekte.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door de National Research Foundation, Prime Minister’s Office, Singapore, onder de NRF onderzoek beurzenstelsel (NRF award neen. NRF-RF2010-10); de Singapore ministerie van volksgezondheid nationale medische Onderzoeksraad (NMRC/CIRG/1358/2013); en het genoom Instituut van Singapore (GIS) / Agentschap voor wetenschap, technologie en onderzoek (A * STAR).
1.5ml eppendorf tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
100% ethanol | For Alcohol Burner | ||
15 ml conical tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
1ml Tuberculin Syringe | BD Biosciences | 302100 | |
3% Bacterial Agar | For static bacterial culture and OD measurement | ||
70% ethanol | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Aesculap anatomic forceps | Braun/Kruuse | BD222R | For initial dissection of mouse (skin, fascia) |
Alcohol Burner | Wheaton | 237070 | |
Aspirating pipette | BD Biosciences | 357558 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Bacterial loops | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424 | Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes |
Conical flasks | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Digital camera for microscope | Olympus | DP71 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Glass Capillaries | Kimax | 6148K07 | |
Iris Scissors STR SS 110MM | Braun | BC110R | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
Kanamycin Sulfate | Calbiochem | 420311 | For static bacterial culture and OD measurement |
LB broth (Miller) | Thermo/Gibco | 10855021 | For static bacterial culture and OD measurement |
Light source unit for microscope | Olympus | LG-PS2 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Lubricant | KY | Any similar commercial medical lubricant will suffice | |
Macro fluorescence microscope | Olympus | MVX10 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Micropipette + micropipette tips | For static bacterial culture and OD measurement | ||
PBS 1x | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Pipette controller + Pipettes | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Polyethylene Tubing | BD Intramedic | 427401 | |
Precision Glide needle 30G | BD Biosciences | 305107 | Possibly under new catalogue number (305106) |
Splinter forceps curved | Braun | BD312R | |
Spray bottle (for ethanol) | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Square cuvettes | Elkay | 127-1010-400 | For static bacterial culture and OD measurement |
Sterilgard III Advance Safety Cabinet | Baker | SG403 | Any biosafety cabinet with a UV irridiator |
Sterilin 90mm Standard Petri Dish | Thermo | 101VR20 | Any sterile petri dish |
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm | Braun | OK366R | Recommended for harvesting of bladder |
Surgical Scissors STR S/B 105MM | Braun | BC320R | |
Tabletop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals |
WPA C08000 cell density meter | Biowave (Biochrom) | 80-3000-45 | For static bacterial culture and OD measurement |