Здесь мы описываем протоколы для анализа и визуализации структуры и Конституции репертуаров всего антитела. Это включает в себя приобретение огромные последовательностей РНК антитела, с помощью следующего поколения последовательности.
Огромную приспособляемость признания антигена антитела является основой приобретенной иммунной системы. Несмотря на наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе производства огромного репертуара антител, приобретенной иммунной системы, он не еще удалось прибыть в глобальное представление о полной антитела репертуар. В частности репертуары клетки B рассматриваются как черный ящик из-за их астрономическое количество антител клонов. Однако секвенирование нового поколения технологии позволяют прорывы увеличить наше понимание клетки B репертуар. В настоящем докладе мы опишем простой и эффективный метод, чтобы визуализировать и анализировать весь отдельных мыши и человеческих антител репертуары. Иммунных органов репрезентивно из селезенки мышей и мононуклеаров периферической крови в организме человека, всего РНК был подготовлен, обратной транскрипции и усиливаются с помощью метода 5′-гонки. Используя универсальный грунт вперед и антисмысловых грунтовки для постоянной доменов класс специфического антитела, антитела mRNAs были равномерно усиливается в пропорциях, отражающие их частоты в популяциях антитела. Ампликонов были упорядочены с помощью следующего поколения последовательности (НГС), давая более 105 антитела последовательности на иммунологические сэмпл. Мы описываем Протоколы антитела последовательности анализов, включая аннотации V (D) J-ген сегмента, птичьего репертуара антител, и наши вычислительные методы.
Антитело система является одной из основ приобретенной иммунной системы. Это очень мощный против вторжения патогенных микроорганизмов из-за его огромного разнообразия, тонкой антигена признание специфики и клоновых расширения антиген специфические клетки. Репертуар антител продуцирующие клетки B оценивается в более чем 1015 в одном отдельных1. Это огромное разнообразие генерируется с помощью VDJ рекомбинации генов иммуноглобулинов генетических локусов2. Описание всей клетки B репертуаров и их динамические изменения в ответ на антиген иммунизации поэтому является сложной, но существенно важное значение для полного понимания реакции антитела против вторгаясь патогенов.
Из-за их астрономических разнообразия клетки B репертуаров было рассматривать как черный ящик; Однако появление NGS технологий позволило прорывы для углубленного понимания их сложности3,4. Антитела весь репертуар успешно анализируются сначала в zebrafish5, затем мышей6и люди6,7. Хотя NGS теперь стал мощным инструментом в изучении адаптивного иммунного ответа, отсутствуют основные анализ общих черт и различий в репертуар антитела среди отдельных животных.
В мышей было сообщено, что репертуаров IgM почти идентичны между людьми, в то время как те IgG1 и IgG2c существенно отличаются между лицами8. В дополнение к V-ген профиль использования наблюдаемая частота VDJ-профиля в наивной периферийные клетки B очень похож между лицами8. Анализ аминокислотных последовательностей VDJ-региона также показал возникновение же соединительной последовательностей в разных мышей намного чаще, чем ранее мысли8. Эти результаты показывают, что механизмы для формирования репертуара антител может быть детерминированным, а не стохастические5,8,9. Процесс развития репертуара антител у мышей также успешно проанализирован с помощью NGS для дальнейшего подчеркнуть потенциал NGS для выявления антител иммунной системы в деталях10.
В настоящем докладе мы опишем простой и эффективный метод, чтобы визуализировать и анализировать репертуара антител на глобальном уровне.
Метод, описанный здесь NGS использует для антитела РНК, усиливаются с помощью метода 5′-гонки. В отличие от методов, использующих вырожденный 5′-VH гена грунты мРНК каждого антитела класса усиливаются, равномерно с помощью универсальной вперед грунтовки. Кроме того использование антисмысловых грунтовки конкретных для региона константа 1 (CH1) ген антител позволяет репертуар профилирование конкретного иммуноглобулинов классов. Это очень полезно для рассечения класс специфических антител ответ, а также для сравнения наивными и прививки репертуаров8,9.
Наиболее вероятным ловушкой метода является нехватка усиливается иммуноглобулина сообщений. Глубина репертуара антител, полученные этим протоколом существенно зависит от амплификации PCR, описанных в пунктах 3.1 и 3.2. Если глубина репертуар не получается правильно, изменив коэффициенты шаблон cDNA и грунтовки в шагах 3.2.1 и 3.2.2 настоятельно рекомендуется.
Как правило около 20% читает антитела, производимые NGS являются неоднозначной последовательности21. Даже с создана «методы коррекции», остаются неоднозначными35-10%. Мы, таким образом, анализ последовательности и фильтруют сырье читает, содержащий подпись последовательности, соответствующей постоянной регионов иммуноглобулина (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1 и т.д.). Поэтому анализ соматических гипер мутации потребностей тщательное обследование.
Один из недостатков этого метода является что иммуноглобулин тяжелые и легкие цепи пара может быть выведен. Отсюда представление репертуар, полученные этим методом не является целостный. Однако это возможно для приближенного топ рейтинге пар путем статистического анализа данных10. Кроме того Роман метод последовательности пар иммуноглобулина было недавно сообщено3,4.
Иммуноглобулин последовательностей в выходных данных .fna были извлечены на основании наличия иммуноглобулина геном подписи последовательностей. V, D и J гена, которую сегменты были затем Аннотированная и производительности V (D) J перестановок были оценены. Область определения взаимодополняемости 3 (CDR3) были также аннотированных последовательностях. Эти систематические экзамены иммуноглобулина последовательностей в данных .fna пользой были предоставлены23,22,IMGT/HighV-квест сервера24. Однако строительство трубопровода автоматизированной обработки имеет заслуги для анализа крупных экспериментальных данных. Конвейер, настроенные для каждой цели можно настроить с помощью отдельного протокола IgBLAST19. Этот подход требует программирования грамоте, но очень полезно для подробного анализа системы иммуноглобулин. Трубопроводов, в описанный являются примерами настраиваемого протокола (рис. 2).
Количество антител читает, дается пропорциональна количество антител РНК в образце, отражающие антитела составляющие антитело системы на время точки5,8,25. Метод, описанный здесь дает птичьего полета V (D) J Конституции репертуара антител, с использованием R-программы-8,–18,–26.
Глобальное представление IgM антител репертуаров отдельных наивно мышей показало высоко сохранены VDJ профиля по сравнению с теми IgG1 или IgG2c8. Было сообщено, что VDJ комбинации незрелых данио рерио, весьма стереотипные9. В отличие от человека VDJ комбинации сообщается чрезвычайно неравномерное6. Весьма сохранены детерминированной VDJ-профили в наивный B клетки являются вероятно либо порожденных перекос VDJ-перестановки или отрицательный отбор с авто антигены, представленные в организме. Например IGHV11-2 выражается преференциально в плода IgM репертуар27 и это преобладание приписывается autoreactivity IGHV11-2 против стареющей эритроцитов27. Интересно, что IGHV11-2 было также наиболее распространенных основных репертуар в нашем анализе опубликованных ранее наивных IgM8.
Метод, описанный здесь полезен для расшифровки репертуаров антиген отзывчивым антитела включительно анализируя антитела репертуар пространства, созданного в отдельных органах, избегая непреднамеренное упущение ключевых антитела репертуаров8, 10. Этот метод также позволяет изучение подробных антитела сети динамизм, который облегчит ускорить открытие защитных антител против новых патогенных организмов.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грант от АМЕДА под Грант номер JP18fk0108011 (KO и SI) и JP18fm0208002 (TS, KO и YO) и субсидий от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии (15K 15159) для KO. Мы благодарим Саюри Ямагучи и Satoko Сасаки за ценную техническую помощь. Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.jp) для английского языка редактирования.
0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |