هنا، يمكننا وصف بروتوكولات للتحليل والتصور للهيكل والدستور لجسم كله مبدع. وهذا ينطوي على الحصول على تسلسل واسعة لاستخدام الجيل التالي تسلسل الحمض النووي الريبي جسم.
التكيف الهائلة مستضد الاعتراف بالأجسام المضادة هو الأساس لنظام المناعة المكتسبة. على الرغم من فهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء إنتاج مرجع الشاسعة من الأجسام المضادة بالمناعة المكتسبة، لم ممكن للتوصل إلى رؤية عالمية لمرجع جسم كاملة. على وجه الخصوص، تعتبر الخلية بمبدع كمربع الأسود بسبب عددها الفلكية من جسم الحيوانات المستنسخة. ومع ذلك، تمكن تقنيات الجيل التالي تسلسل اختراقات لزيادة فهمنا لمرجع الخلية ب. وفي هذا التقرير، يصف لنا طريقة بسيطة وفعالة لتصور وتحليل الماوس الفردية كاملة ومبدع جسم الإنسان. من أجهزة المناعة، بالإسم من الطحال في الفئران وخلايا الدم المحيطية وحيدات النوى في البشر، ومجموع الجيش الملكي النيبالي كان مستعدا، عكس نسخها، والتوسع في استخدام أسلوب 5 ‘–سباق. استخدام تمهيدي إلى الأمام عالمي والعقاقير كبسولة تفجير للمجالات جسم ثابت فئة معينة، تم تضخيم مرناس جسم موحد بنسب تعكس تلك الترددات في جسم السكان. كانت متسلسلة أمبليكونس من الجيل التالي التسلسل (خ ع)، مما أسفر عن أكثر من 10 تسلسلات جسم5 كل عينة المناعية. يصف لنا البروتوكولات لتحاليل تسلسل جسم بما في ذلك الشرح الخامس (د) ي-جين-الجزء، عرضاً بديعا لمرجع الأجسام المضادة، ولدينا طرق حسابية.
نظام الأجسام المضادة واحد من المبادئ الأساسية لنظام المناعة المكتسبة. أنها قوية للغاية ضد غزو الجراثيم بسبب تنوعها واسعة، مستضد غرامة الاعتراف بخصوصية، والتوسع في الاستنساخ من خلايا ب حدة مستضد. مرجع الخلايا المنتجة للأجسام المضادة ب يقدر بأكثر من 1015 في كل واحدة1. يتم إنشاء هذا التنوع الهائل بمساعدة فدج المورثات جزئ في المكاني الوراثي الغلوبولين المناعي2. وصف مبدع بالخليه بأكملها وعلى التغيرات الدينامية في الاستجابة للتحصين مستضد فصعبة ولكن ضرورية لفهم كامل لاستجابة الأجسام المضادة ضد غزو العوامل الممرضة.
بسبب تنوعها الفلكية، تعتبر الخلية بمبدع كمربع الأسود؛ ومع ذلك، قد مكن ظهور التكنولوجيا خ ع اختراقات لفهم أفضل لما تعقد3،4. مبدع جسم كله قد تم بنجاح تحليلها، أولاً في الزرد5، ثم من الفئران،6، والبشر6،7. على الرغم من أن خ ع أصبحت الآن أداة قوية في دراسة الاستجابة المناعية التكيفية، تفتقر إلى التحليلات الأساسية لأوجه التشابه والاختلاف في جسم مبدع بين الحيوانات الفردية.
في الفئران، أفيد بأن مبدع IgM تكاد تكون متطابقة بين الأفراد، بينما IgG1 و IgG2c تختلف اختلافاً كبيرا بين الأفراد8. بالإضافة إلى استخدام الجين الخامس الشخصية، تواتر فدج-الشخصية في السذاجة الطرفية ب خلايا الملاحظة متشابهة جداً بين الأفراد8. تحليل سلاسل الأحماض الأمينية فدج-المنطقة كما أظهرت حدوث نفس تسلسل هالة في الفئران مختلفة أكثر بكثير مما سبق الفكر8في كثير من الأحيان. تشير هذه النتائج إلى أن الآليات اللازمة لتشكيل جسم مرجع يمكن أن تكون قطعية بدلاً من العشوائية5،،من89. عملية التنمية مرجع الأجسام المضادة في الفئران قد أيضا تم بنجاح تحليل استخدام خ ع لزيادة تسليط الضوء على إمكانات خ ع للكشف عن الأجسام المضادة المناعي في التفصيل10.
في هذا التقرير، يصف لنا طريقة بسيطة وفعالة لتصور وتحليل جسم مرجع ممارسات مجلس الأمن على الصعيد عالمي.
ويستخدم الأسلوب الموصوفة هنا خ ع للجيش الملكي النيبالي جسم تضخيم استخدام الأسلوب 5 ‘–سباق. على النقيض من الأساليب التي تستخدم منحط 5 ‘-Vح الجينات الإشعال، تتضخم مرناس كل فئة جسم بالتساوي باستخدام كبسولة تفجير الأمام العالمي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العقاقير كبسولة تفجير محددة لمنطقة الثابت 1 (CH1) من الجينات جسم مرجع التنميط لفئات محددة الغلوبولين المناعي. وهذا مفيد جداً لتشريح استجابة جسم فئة معينة، فضلا عن مقارنة ساذجة ومبدع المحصنين8،9.
شرك الأسلوب الأكثر احتمالاً ندرة رسائل تضخيم الغلوبولين المناعي. عمق جسم المرجع التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول إلى حد كبير يعتمد على التضخيم PCR هو موضح في الخطوات 3.1 و 3.2. تغيير نسب كدنا القالب والإشعال في الخطوات 3.2.1 أو 3.2.2 ينصح بشدة إذا لم يتم الحصول بشكل صحيح على عمق مرجع ممارسات مجلس الأمن،.
وبصفة عامة، هي حوالي 20% القراءات الأجسام المضادة التي تنتجها خ ع تسلسلات غامضة21. حتى مع إنشاء “طرق التصحيح”، 5-10% تبقى غامضة3. ولذلك، نحن، تحليل التسلسل وتصفية يقرأ الخام التي تحتوي على تسلسلات التوقيع المقابلة لمناطق ثابتة الغلوبولين المناعي (CμH1، Cγ1H1، Cγ2cH1، إلخ.). ومن ثم تحليل فرط الطفرات الجسدية يحتاج الفحص الدقيق.
واحد أوجه القصور في هذا الأسلوب هو أن جسم ثقيل وزوج سلسلة الخفيفة غير قادر على الاستدلال. ومن ثم رأي المرجع التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة ليس كلي. ومع ذلك، من الممكن لتقريب أزواج كبار بالتحليل الإحصائي ل البيانات10. أيضا، وطريقة جديدة لتسلسل أزواج الغلوبولين المناعي وقد أفادت مؤخرا3،4.
استخرجت في تسلسل الغلوبولين المناعي في البيانات.fna الإخراج استناداً إلى وجود الغلوبولين المناعي مورثة تسلسل التوقيع. تم تقييم الجين الخامس ود ي ثم تم المشروح شرائح وإنتاجية الخامس (د) ي ترتيبات جديدة. منطقة تحديد التكامل 3 (CDR3) كما كان المشروح متواليات. وقدمت هذه الفحوص المنتظمة لتسلسل الغلوبولين المناعي في البيانات.fna مفيد23،22،الخادم إيمجت/هيغف–كويست24. ومع ذلك، بناء خط أنابيب معالجة إليه بميزة لتحليل البيانات التجريبية كبيرة. خط الأنابيب مخصصة لكل غرض من الممكن إعداد باستخدام مستقل إيجبلاست البروتوكول19. هذا النهج يحتاج محو الأمية البرمجة الأساسية ولكن مفيد جداً لتحليلات مفصلة للنظام المناعي. خطوط الأنابيب ووصف أمثلة لبروتوكول مخصص (الشكل 2).
يقرأ العدد من الأجسام المضادة النسبي لكمية الأجسام المضادة الكشف في العينة، مما يعكس مكونات نظام الأجسام المضادة في جسم تعطي الوقت النقاط5،،من825. الأسلوب الموصوفة هنا يعطي رأي العين طائر من دستور الخامس (د) ي مرجع جسم استخدام البحث والتطوير البرامج8،،من1826.
العالمية ويرى مبدع الأجسام المضادة IgM الفئران فردية ساذجة كشفت فدج-الشخصية مصانة عاليا بالمقارنة مع تلك التي IgG1 أو IgG2c8. وذكر أن مجموعات فدج من الزرد غير ناضجة جداً النمطية9. وفي المقابل، يقال البشرية فدج تركيبات منحرفة جداً6. هي العالية حافظ فدج-التشكيلات الجانبية القطعية في الخلايا من السذاجة ب التحديد ربما ولدت أما بانحراف فدج-ترتيبات جديدة أو السلبية مع السيارات-مولدات المضادات في الجسم. على سبيل المثال، IGHV11-2 يتم التعبير عن تفضيلي في مرجع IgM الجنين27 وهيمنة هذا يعزى إلى أوتوريكتيفيتي IGHV11-2 ضد الكريات الحمراء مسن27. من المثير للاهتمام، IGHV11-2 هو أيضا مرجع الرئيسية الأكثر شيوعاً في تحليلنا المنشورة سابقا من السذاجة IgM8.
الأسلوب الموصوفة هنا مفيد لفك رموز مبدع جسم مستضد المستجيبة من خلال تحليل الفضاء جسم-مرجع ممارسات مجلس الأمن التي تم إنشاؤها في الهيئات كل على حدة، تجنب إغفال غير مقصود من جسم الرئيسية مبدع8، جامعاً 10. يسمح هذا الأسلوب أيضا دراسة مفصلة جسم شبكة دينامية، مما ييسر تسارع اكتشاف أجسام مضادة واقية ضد الناشئة حديثا ومسببات الأمراض.
The authors have nothing to disclose.
بتأييد هذا العمل بمنحه من أوسطي تحت رقم المنحة JP18fk0108011 (كو و SI) و JP18fm0208002 (TS وكو ويو)، ومعونات من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (15 ك 15159) إلى كو. ونشكر ياماغوتشي سايوري وساتوكو ساساكي للمساعدة التقنية القيمة. ونود أن نشكر اديتاجي (www.editage.jp) لتحرير اللغة الإنجليزية.
0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |