Summary

Листерий Инфекция мозга

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

Во время инфекции Listeria monocytogenes способна пересечения blood – brain барьер колонизировать мозга. В этом протоколе мы продемонстрируем оценить бактериальной колонизации органов после инфицирования мышей. Предусмотрена процедура для выполнения весь орган перфузии для конкретного определения бактериальной чисел в паренхиме мозга.

Abstract

Листерий является внутриклеточных бактериальных патогенов, который часто ассоциируется с пищевыми инфекции. L. моноцитогенес возможность пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) относительно как это может привести к жизни менингит и энцефалит. BBB защищает мозг микроокружения от различных токсических метаболитов и патогенных микробов в крови после инфекции и поэтому поддерживает гомеостаза головного мозга. Механизмы, которыми л моноцитогенес в кровь Креста BBB, чтобы вызвать мозг инфекции полностью не поняты и есть также отсутствие системы надежную модель для изучения мозга инфекций л моноцитогенес. Здесь мы представляем простой мыши инфекции модель для определения ли бактерии пересекли BBB и quantitate бремя бактерий, которые колонизировали мозга в естественных условиях. В этом методе животные были инфицированы внутривенно с L. моноцитогенес и были гуманно euthanized под воздействием CO2 следуют шейки матки дислокации. Сердца перфузии животных была выполнена до уборки инфицированных органов. Кровь была собрана до перфузии и количество бактерий на орган или мл крови определяется покрытие разведениях крови или орган гомогенатах на плитах агара и подсчитывать количество колоний сформирован. Этот метод может использоваться для изучения взаимодействия Роман рецептор лиганд, которые повышают инфекции мозга, L. моноцитогенес и может быть легко адаптирована для изучения нескольких бактериальных патогенов.

Introduction

Грамположительные бактерии листерий является факультативной внутриклеточных патогенов и один из наиболее смертоносных пищевых патогенов во всем мире. Проглатывание л моноцитогенес загрязненных продуктов питания может привести к листериоз в организме человека, тяжелой инвазивное заболевание ориентации основном беременных женщин, новорожденных, пожилым и ослабленным иммунитетом лица1. L. моноцитогенес является одной из ведущих причин смерти в результате пищевого патогена в США и летальности от листериоз достигает 20 – 30%, самый высокий для всех пищевых патогенов2. Для л моноцитогенес в настоящее время существует нет вакцины и способность бактерий, эффективно распространяться в дистальной органов и мозг через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) может привести к жизни менингит и колонизации мозга3 , 4 , 5 , 6. Бактериальный менингит обычно суров; Хотя большинство людей, которые получают лечение выздоравливают, инфекции может вызвать серьезные осложнения, например, повреждения головного мозга, потеря слуха или обучения инвалидов в детей. L. моноцитогенес прогнозам, приходится менее 10% всех сообщества приобрели менингита в США7.

Основным маршрутом для бактериального распространения мозга и мозговых оболочек — через кровь. Бактерии, циркулирующих в кровеносных сосудов в мозге могут пересекать BBB вызывают инфекции головного мозга. BBB является системой весьма васкуляризированной барьер, защищающий мозг от посторонних частиц, циркулирующих в крови. Эндотелиальные клетки образуют слой, что линии внутренней поверхности кровеносных сосудов8,9. В дополнение к л monocytogenesнесколько бактериальных патогенов, таких как Neisseria meningitidis, пневмококк, кишечная палочкаи Haemophilus influenzae типа b (Hib) способны колонизации мозг, перейдя в BBB3,4,5,6. Однако при изучении бактериальной нагрузки в головном мозге зараженных мышей, важно определить ли бактерии пересекли BBB, в противном случае бактериальной нагрузки в головном мозге может представлять бактерий, которые все еще находятся в кровеносных сосудов мозга. Таким образом это необходимо для perfuse мышей всех крови до определения формирования колонии единиц (CFU) гомогенатах мозга.

В этом исследовании мы описываем в vivo методы для изучения л моноцитогенес инфекции мозга. Для методов, описанных здесь мы использовали л моноцитогенес штамм 10403S. L. моноцитогенес 10403S является одним из наиболее широко используемых лабораторных штаммов для изучения системных листериоз в мышиной модели инфекции10. Этот протокол основан на стандартных внутривенным введением л моноцитогенес следуют перфузии мышей. Схематический план инфекции протокола в мышах показано на рисунке 1. L. monocytogenes-инфицированных мозги и других органов от-увлажненную или перфузии мышей были собраны и бремя бактериальных органа определяется. Эти методы являются полезными для определения не только общей бактериальной колонизации мозга в зараженных животных, но также являются полезными для определения, является ли бактерии проникли BBB в vivo посредником вторжения головного мозга. Важно подчеркнуть, что этот протокол лаборатория должна проводиться после консультаций с руководством Фонда соответствующих институциональных биобезопасности Комитета и животных.

Protocol

Все животные должны быть сохранены и обработаны с максимальной осторожностью, чтобы свести к минимуму дискомфорт во время процедуры. Процедура должна проводиться в соответствии с использование Комитета и институциональный уход животных и все федеральные, государственные и местные з?…

Representative Results

Мозг очень васкуляризированной и L. моноцитогенес известен заразить типы клеток в крови3,13. Описывается протокол используется для демонстрации способности л моноцитогенес пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) приводит к…

Discussion

L. monocytogenes способна вызвать менингоэнцефалит, угрожающих жизни людей. Предыдущие исследования показали способность бактерий пересечь blood-brain барьер (BBB) и колонизировать мозга. Были предложены три маршрута мозга вторжения во время инфекции: прямое проникновение BBB бактериями, стелс …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения США Грант AI103806 от национальных институтов здоровья.

Materials

Brain Heart Infusion media Becton Dickinson 237200
Streptomycin sulfate  Amresco 0382-50G
Petri dishes VWR 25384-342
Glycerol VWR 97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer IKA 3352109 Model: T18BS1
Spectrophotometer Beckman Coulter DU 800 series
BALB/c mice Jackson Laboratory Model #000651
1 mL syringes Becton Dickinson 309659
26-gauge needles Becton Dickinson 305115
21-gauge butterfly needles Becton Dickinson 367281
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich 60004
15 mL conical tubes VWR 21008-918
Round-bottom test tubes VWR 60819-546
Phosphate-buffered saline  Corning 46-013-CM
Stainless steel spatula VWR 82027-520
Stainless steel scissors (6.5 in) VWR 82027-592
Stainless steel scissors (4.5 in) VWR 82027-578
Stainless steel blunt forceps  (4.5 in) VWR 82027-440
Stainless steel fine tip forceps  (6 in) VWR 82027-406

References

  1. Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
  2. de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
  3. Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
  4. Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
  5. Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
  6. Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
  7. Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
  8. Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
  9. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  10. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  11. Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
  12. Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
  13. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  14. Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
  15. Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
  16. Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ghosh, P., Higgins, D. E. Listeria monocytogenes Infection of the Brain. J. Vis. Exp. (140), e58723, doi:10.3791/58723 (2018).

View Video