Summary

Listeria monocytogenes Infecção do cérebro

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

Durante a infecção, a Listeria monocytogenes é capaz de atravessar a barreira hemato – encefálica para colonizar o cérebro. Neste protocolo, demonstramos como avaliar a colonização bacteriana de órgãos após a infecção de camundongos. Está previsto um procedimento para executar a perfusão de órgão inteiro para determinação específica dos números bacterianas do parênquima cerebral.

Abstract

Listeria monocytogenes é um patógeno bacteriano intracelular que está frequentemente associado com infecção de origem alimentar. A capacidade de L. monocytogenes de atravessar a barreira hemato – encefálica (BBB) é relativo, pode levar a risco de vida meningite e encefalite. O BBB protege o microambiente do cérebro de vários metabólitos tóxicos e patógenos microbianos no sangue após a infecção e, portanto, suporta a homeostase do cérebro. Os mecanismos pelos quais L. monocytogenes presente na corrente sanguínea cruzar o BBB para causar cérebro infecções não são totalmente compreendidas e há também a falta de um sistema de modelo robusto para estudar infecções cerebrais por L. monocytogenes. Aqui, apresentamos um modelo de infecção de mouse simples para determinar se as bactérias cruzaram o BBB e para dosar a carga de bactérias que colonizaram o cérebro em vivo. Neste método, os animais foram infectados por via intravenosa com L. monocytogenes em humanamente foram sacrificados por exposição ao CO2 , seguido por deslocamento cervical. Perfusão cardíaca dos animais foi realizada antes da colheita de órgãos infectados. Sangue foi coletado antes da perfusão e o número de bactérias por órgão ou mL de sangue foi determinada por chapeamento diluições do sangue ou órgão homogenates em placas de ágar e contando o número de colônias formadas. Esse método pode ser usado para estudar interações ligante-receptor romance que aumentam a infecção do cérebro por L. monocytogenes e podem ser facilmente adaptado para o estudo de vários patógenos bacterianos.

Introduction

A bactéria Gram-positiva Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo e um dos maioria dos mortais comida patógenos em todo o mundo. Ingestão de alimentos de L. monocytogenes contaminado pode levar a listeriose em humanos, uma grave doença invasiva visando principalmente grávidas, os recém-nascidos, os indivíduos idosos e imunocomprometidos1. L. monocytogenes está entre as principais causas de morte por um patógeno de origem alimentar nos Estados Unidos e taxas de fatalidade casos de listeriose são tão elevadas como 20 a 30%, o mais elevado para todos os agentes patogénicos de origem alimentar2. Nenhuma vacina atualmente existe para L. monocytogenes e a capacidade das bactérias para efetivamente espalhou para o cérebro e órgãos distais por atravessar a barreira hemato – encefálica (BBB) pode levar a risco de vida meningite e colonização do cérebro3 , 4 , 5 , 6. meningite bacteriana é geralmente severa; enquanto a maioria das pessoas que recebem tratamento recuperam, infecções podem causar sérias complicações, por exemplo, danos cerebrais, perda de audição ou dificuldades de aprendizagem em crianças. L. monocytogenes é previsto compensar pelo menos 10% de toda a Comunidade adquiriu meningite no EUA7.

Uma importante rota para a disseminação bacteriana para o cérebro e as meninges é através da corrente sanguínea. Bactérias circulantes em vasos sanguíneos no cérebro são capazes de atravessar o BBB para causar infecção cerebral. O BBB é um sistema altamente vascularizado barreira que protege o cérebro de partículas estranhas que circulam no sangue. Células endoteliais constituem uma camada que reveste a superfície interior do vasos sanguíneos8,9. Além de L. monocytogenes, vários agentes patogénicos bacterianos como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colie Haemophilus influenzae tipo b (Hib) são capazes de colonizar o cérebro através do cruzamento do BBB3,4,5,6. No entanto, ao examinar a carga bacteriana no cérebro de ratos infectados, é importante determinar que se as bactérias cruzaram o BBB, caso contrário a carga bacteriana no cérebro pode representar as bactérias que são ainda nos vasos sanguíneos do cérebro. Assim, é necessário perfundir os ratos de todo o sangue antes da determinação de unidades formadoras de Colônia (UFC) dos homogenates do cérebro.

Neste estudo, descrevemos na vivo métodos para examinar a infecção de L. monocytogenes do cérebro. Para os métodos descritos aqui, usamos a L. monocytogenes estirpe 10403S. L. monocytogenes 10403S é uma das variedades de laboratório mais amplamente utilizado para estudar a listeriose sistêmica no modelo do rato de infecção10. Este protocolo é baseado em padrão injecção intravenosa de L. monocytogenes , seguido de perfusão dos ratos. Um esboço esquemático do protocolo de infecção em camundongos é mostrado na Figura 1. L. monocytogenes-cérebros infectados e outros órgãos de ratos perfundidos ou não perfundidos foram coletados e a carga bacteriana órgão determinado. Esses métodos são úteis para determinar não só a colonização bacteriana total do cérebro de animais infectados, mas também são benéficos para determinar se a bactéria ter penetrado o BBB na vivo para mediar a invasão do cérebro. É importante salientar que este protocolo do laboratório deve ser realizado após consulta com a gestão de instalações de biossegurança institucional relevante Comissão e animal.

Protocol

Todos os animais estão a ser mantida e tratada com o máximo cuidado para minimizar o desconforto durante o curso do procedimento. O procedimento está a ser conduzida em conformidade com o cuidado de Animal institucional e Comissão de uso e todas as leis federais, estaduais e locais. Observe também que os experimentos de laboratório devem ser conduzidos de acordo com as diretrizes de biossegurança nível 2. 1. crescimento de L. monocytogenes para estudos de infecção de Mouse…

Representative Results

O cérebro é altamente vascularizado e L. monocytogenes é conhecido para infectar os tipos de células presentes no sangue3,13. O protocolo descrito é usado para demonstrar a capacidade de L. monocytogenes de atravessar a barreira hemato – encefálica (BBB) levando a infecção do cérebro de ratos. Para determinar se as bactérias cruzaram o BBB na vivo, perfusão de sangue no mouse é executada ante…

Discussion

L. monocytogenes é capaz de causar meningoencefalite fatais em seres humanos. Estudos prévios têm demonstrado a capacidade das bactérias para atravessar a sangue-cérebro-barreira (BBB) e a colonizar o cérebro. Três rotas de invasão do cérebro têm sido propostas durante a infecção: direto a penetração do BBB por bactérias, stealth transporte por bactérias contidas dentro de células mononucleares3e migração axonal por cepas de L. monocytogenes que causam rhombenc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública dos EUA conceder AI103806 do National Institutes of Health.

Materials

Brain Heart Infusion media Becton Dickinson 237200
Streptomycin sulfate  Amresco 0382-50G
Petri dishes VWR 25384-342
Glycerol VWR 97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer IKA 3352109 Model: T18BS1
Spectrophotometer Beckman Coulter DU 800 series
BALB/c mice Jackson Laboratory Model #000651
1 mL syringes Becton Dickinson 309659
26-gauge needles Becton Dickinson 305115
21-gauge butterfly needles Becton Dickinson 367281
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich 60004
15 mL conical tubes VWR 21008-918
Round-bottom test tubes VWR 60819-546
Phosphate-buffered saline  Corning 46-013-CM
Stainless steel spatula VWR 82027-520
Stainless steel scissors (6.5 in) VWR 82027-592
Stainless steel scissors (4.5 in) VWR 82027-578
Stainless steel blunt forceps  (4.5 in) VWR 82027-440
Stainless steel fine tip forceps  (6 in) VWR 82027-406

References

  1. Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
  2. de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
  3. Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
  4. Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
  5. Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
  6. Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
  7. Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
  8. Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
  9. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  10. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  11. Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
  12. Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
  13. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  14. Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
  15. Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
  16. Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ghosh, P., Higgins, D. E. Listeria monocytogenes Infection of the Brain. J. Vis. Exp. (140), e58723, doi:10.3791/58723 (2018).

View Video