הקמת קו יציב תא overexpressing הגן עניין ללמוד פונקציה ג’ין יכול להיעשות על ידי שיבוטים יחיד יציב של חיטוט תרביות תאים לאחר transfecting אותם באמצעות retroviral זיהום. הנה אנחנו מראים כי HT29-DR3 שורות תאים שנוצרו בדרך זו להבהיר את מנגנוני מוות איזה קולטן 3 (DR3) תורמת antimitotics-induced אפופטוזיס.
לומד את הפונקציה של הגן עניין יכולה להיות מושגת על-ידי מניפולציה לרמת הביטוי, כגון הפחתת הביטוי שלה עם שורות תאים תמונות ציפורים או להגדיל את הביטוי שלה עם שורות תאים ביטוי. תרביות תאים ארעית ויציבה הם שתי שיטות שבהן משמשים לעתים קרובות על ביטוי גנים אקסוגני. תרביות תאים ארעי שימושית רק ביטוי לטווח קצר, ואילו תקנים יציב מאפשר גנים אקסוגני לשלב את הגנום של התא המארח היכן זה ברציפות יתבטא. כתוצאה מכך, תרביות תאים יציב בדרך כלל מועסק למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. כאן נתאר פרוטוקול פשוט כדי ליצור קו יציב תא overexpressing מוות מתויג קולטן 3 (DR3) לחקור פונקציה DR3. בחרנו שיבוטים יחיד לאחר זיהום retroviral על מנת לשמור על הומוגניות של טוהר השורות תא יציב. הקווים תא יציב שנוצר באמצעות פרוטוקול זה לבלתי DR3 לקויה HT29 תאים רגישים לסמים antimitotic, ובכך לשחזר את התגובה אפופטוטיים להיפגע בתאים HT29. יתר על כן, התג דגל על DR3 מפצה על אי זמינות של נוגדן DR3 טוב ואסטמה ומקילה על המחקר הביוכימי של המנגנון המולקולרי שבאמצעותו סוכנים antimitotic לגרום אפופטוזיס.
ביטוי גנים heterologous הוא מועסק בדרך כלל ללמוד את התפקוד של הגנים של עניין. שתי השיטות, תרביות תאים ארעית ויציבה, משמשים prevalently תאים וביולוגיה מולקולרית כדי להוסיף מקטע של DNA או RNA1,תא מארח2. ה-DNA או RNA transiently transfected שאי אפשר לעבור לתאי הבת, אז שינוי גנטי יכול להישמר רק לתקופה קצרה של זמן. מצד שני, stably transfected תאים, גנים אקסוגני משולבים לתוך הגנום התא המארח, סופגת ביטויה של הקו הסלולרי. לפיכך, תרביות תאים יציבה היא שיטה זה שמורה בדרך כלל למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. גם יכול להיות מושתלים הקו הסלולרי יציב כמו xenografts לתוך עכבר מודלים עבור ויוו ללמוד3. תרביות תאים יציבה ניתן לחלק לשתי קטגוריות: ויראלי, nonviral. לעומת תקנים nonviral, זיהום ויראלי יכול להעביר גנים לתוך מגוון רחב יותר של תאים אנושיים עם גבוה יותר יעילות4,5,6,7. יתר על כן, קו יציב תא שיבוט יחיד מציעה את היתרון של הומוגניות וטוהר המשובטים.
גידול תאים בלתי מבוקרת וחילוק הם בעלי התכונות להבחין ביותר של סרטן. הגדרות קליני, סוכנים antimitotic הם הטיפולים העיקרי עבור סוגים רבים של גידולים8. עם זאת, שאי אפשר להתעלם ממנו כמה מגבלות משמעותיות של סוכנים antimitotic. ראשית, אלה chemotherapies גם יכול להרוג תאים נורמליים יחד עם תאים סרטניים רצויה, לפיכך, יכול לגרום תופעות לוואי חמורות8. שנית, antitubulin סמים אינם יעילים נגד כל סוגי גידולים, למרות ביטוי בכל מקום של טובולין במגוון רחב של רקמות שונות כמו חלבון cytoskeletal9,10. לא ברור מדוע סוכנים antitubulin הראה מבטיח יעילות כנגד השחלות, ריאות, סרטן hematological בטיפול קליני, אך לא כליה, המעי הגס או סרטן הלבלב11. בסופו של דבר, אפילו חולים עם אותו סוג של גידול יכול להשיב antimitotics באופן שונה באופן בלתי צפוי. אולי יש מולקולה אפקטור המפתח המשפיעה על הרגישות של מטופלים שונים לסוכנים antimitotic, וכתוצאה מכך התוצאות מגוונות ראיתי טיפול רפואי12. לפיכך, פוטנציאל שהיא התכוונה דיפרנציאלית של חולים לטיפול antimitotic צריך לקחת בחשבון כדי לייעל התערבויות טיפוליות13.
מסך ספריית תפוקה גבוהה הגנום כולו siRNA הפגינו DR3 נוקאאוט לחסרת רגישות תאים עמידים בפני תרופות antimitotic, שמערבות תפקיד עבור DR3 אפופטוזיס כימותרפיה14. כחבר superfamily קולטן (TNFR) הגידול נקרוזה מקדם, דווח DR3 לתווך תא אפופטוזיס שונים מערכות15,16,17,18. לפיכך, יצאנו להקים שורות תאים יציב overexpressing DR3 ללמוד המנגנון המולקולרי שבאמצעותו סמים antimitotic לגרום אפופטוזיס. מודל תאים מתאים עבור הלומדים DR3 ביטוי יכולה להינתן על ידי הקו התא סרטן המעי הגס האנושי HT29, אשר נמצאה להיות DR3 לקויה. בנוסף, במרפאה, סרטן המעי הגס הם רגישות antimitotic סמים19.
במאמר זה, אנו מתארים שיטה המאפשרת את הדור של קו יציב תא HT29-DR3 דרך retroviral זיהום. בהמשך נראה כיצד לאמת את הביטוי DR3 בתאים אלה באמצעות סופג המערבי וכיצד להעריך את הרגישות לסוכנים antimitotic על-ידי שימוש assay הכדאיות תא והתבוננות מורפולוגי. התאים הם מוגבר מן שיבוטים יחיד, ולכן, יש את היתרון של רקע גנטי הומוגני. בנוסף, דגל תג על DR3 מותר עבור הפריט החזותי של DR3 התאית על ידי מיקרוסקופ וניתוח של ג’ין ביטוי וחלבון אינטראקציה על ידי גישות הביוכימי. יתר על כן, התאים ניתן xenografted בעכברים לנתח יותר התקדמות הגידול בתגובה antimitotics ויוו14.
תא HT29-DR3 המערכת המוצגת כאן מוצעים כלי יעיל עבור הלומדים את המנגנונים המולקולריים של מה antimitotics להרוג את תאי הסרטן14. מאז ביטוי וקווים תא תמונות ציפורים הם כלים נפוצים ללמוד תפקוד הגן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות גנים אחרים מעניינים או שורות תאים אחרים והפכו, לפיכך, גישה בשימוש נרחב.
כתב יד זה, אנו מתארים שיטה ליצירת שורות תאים יציב HT29-DR3. תאים HT29-DR3 מספקות מודל לימוד המנגנון המולקולרי שבאמצעותו DR3 תורמת אפופטוזיס המושרה על ידי סוכנים antimitotic. גישה זו היא תכליתי הדיר. כדי להבטיח ההצלחה של ההליך, ארבעה שלבים מרכזיים של הפרוטוקול צריך להיחשב. ראשית, על מנת לייצר גבוה מספיק כי?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים 53110000117 (כדי G.W.) ו 043222019 (ל X.W.) מאוניברסיטת צינג.
DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
Anti-mouse secondary antibody | |||
anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |